基于表面自聚合的多功能納米探針制備及性能研究

湯雯 邊靜

摘 要：針對傳統納米探針無法實現核磁共振成型和光熱穩定性較差的問題，提出用表面自聚合方法，用PDA包覆Bi2S3，然后與具有MRI性能的Gd3+離子進行螯合，合成釓離子修飾的硫化鉍@聚多巴胺（Bi2S3@PDA-Gd3+）復合納米探針。通過光學成像儀、磁共振成像儀和動物試驗對其性能進行表征。結果表明：體外光聲信號強度和體外T1磁共振強度與Bi2S3@PDA-Gd3+濃度表現出良好的線性關系;小鼠尾部靜脈注射Bi2S3@PDA-Gd3+8 h后，光聲強度值最高為490.424 a.u，隨時間的增加，仍表現出良好的光聲成像性能;在T1狀態下磁共振成像發現，注射4 h后，Bi2S3@PDA-Gd3+在腫瘤處富集，增加腫瘤明亮度。隨時間改變，成像效果改變不明顯。證實Bi2S3@PDA-Gd3+納米探針能夠為腫瘤診斷及治療都提供了更精準的技術手段。

關鍵詞：納米探針;磁共振;光聲成像;腫瘤治療;硫化鉍@聚多巴胺（Bi2S3@PDA-Gd3+）

中圖分類號：TQ323

文獻標識碼：A文章編號：1001-5922（2022）03-0022-05

Preparation and properties of multifunctional nanoprobesbased on surface self-polymerization

TANG Wen， BIAN Jing

（Sichuan Kexuecheng Hospital， Chengdu 610000， China）

Abstract：

In order to solve the problem that the traditional nano probe could not achieve NMR molding and poor photothermal stability， surface self-polymerization method was proposed to synthesize gadolinium ion modified bismuth sulfide polydopamine by coating Bi2S3 with PDA and chelating with Gd3+ ion with MRI performance （Bi2S3@PDA-Gd3+） composite nanoprobe. Its performance was characterized by optical imager， magnetic resonance imager and animal experiment. The results showed that the intensity of photoacoustic signal in vitro and T1 magnetic resonance intensity in vitro were significantly different from that in vitro Bi2S3@PDA-Gd3+. The concentration showed a good linear relationship; Intravenous injection in the tail of mice Bi2S3@PDA-Gd3+ 8 h resulted the? highest photoacoustic intensity of 490.424 a.u.. With the increase of time， it still shows good photoacoustic imaging performance; In T1 state， MRI showed that after 4 h of injection， Bi2S3@PDA-Gd3+? enrichment in the tumor， increase the brightness of the tumor. With the change of time， the imaging effect did not change significantly. confirm Bi2S3@PDA-Gd3+ nanoprobes can provide more accurate technical means for tumor diagnosis and treatment.

Key words：

nano probe; magnetic resonance imaging; photoacoustic imaging; cancer treatment; Bi2S3@PDA-Gd3+

光熱治療是目前治療腫瘤最有效的一種醫學手段，通過光熱探針產生局部高溫，殺死病灶處腫瘤細胞。在光熱治療中引入成像技術可以有效提高治療的精準性。但傳統常用納米探針無法實現核磁共振成型，因此多模式成像功能的納米光熱探針的合成是目前研究的重點。對此，我國很多學者也作出了一些研究，針對TME響應的19F-MR納米分子成像探針進行深入研究，證實19F-MR納米探針在特定條件下，可在分子水平早期可視化TME中的惡性生物學行為，為實現腫瘤早期診斷及精準治療提供有利支持[1];用線粒體作為線粒體靶向AIE探針區分癌細胞與正常細胞的靶標，使得聚集誘導發光探針能對癌癥細胞進行準確診斷[2];通過水熱法合成熒光生物質碳點BCDs，并將其應用到細胞成像中[3];以上專家的研究為納米探針的合成作出了貢獻，但在納米探針成像方面還存在不足。基于此，本文用表面自聚合方法合成釓離子修飾的硫化鉍@聚多巴胺（Bi2S3@PDA-Gd3+）復合納米探針。設計試驗證實Bi2S3@PDA-Gd3+納米探針能夠為腫瘤診斷及治療都提供了更精準的技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

本試驗主要材料：聚乙烯吡咯烷酮（PVP，山東豪順化工有限公司，AR）、硫代乙酰胺（TAA，山東豪順化工有限公司，AR）、甘露醇 （AR，山東富禾生物科技有限公司）、硫代乙酰胺 （AR，山東豪順化工有限公司）、三（羥甲基）氨基甲烷 （BR，濟南匯錦川化工有限公司）、六水合氯化鐵（AR，山東力昂新材料科技有限公司）、鹽酸多巴胺 （98%，西安澤朗生物科技有限公司）、六水合氯化釓（99.9%，山東力昂新材料科技有限公司）、超純水（18 MΩ/cm，上海景純水處理技術有限公司）。

本試驗主要設備：精密電子天平（H0503，河北德科機械科技有限公司）、高速離心機（TG16KR，上海繼譜電子科技有限公司）、紫外/可見光分光光度計（U-T6，屹譜儀器制造（上海）有限公司）、激光粒度儀（LS-POP（9），珠海市歐美克儀器有限公司）、光學成像儀（Nexus 128，廣州云星科學儀器有限公司）、臨床前緊湊型磁共振成像儀（uMR 560，上海聯影醫療科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 Bi2S3納米顆粒的合成

（1）在25 mL純水中溶入1 g PVP，攪拌均勻后加入甘露醇0.227 5 g和Bi（NO3）3·5H2O，充分攪拌使其完全溶解;

（2）用H0503型精密電子天平精準稱取TAA 0.028 g，放入10 mL超純水中，充分攪拌溶液;

（3）將以上步驟溶液混合，緩慢提升反應溫度使其充分反應，反應溫度和時間分別為100 ℃和1 h;

（4）取出反應產物，然后置于TG16KR型高速離心機中洗滌3次，離心轉速和每次清洗時間分別為10 000 r/min和10 min。然后將洗滌后產物放入體積一定的超純水中，攪拌使其充分溶解，配制成質量濃度為1 mg/mL的Bi2S3溶液備用。

1.2.2 Bi2S3@PDA鈉米顆粒的合成

（1）用H0503型精密電子天平分別精準稱取4.5 mg鹽酸多巴胺、6.2 mg FeCl3·6H2O4，然后依次放入130 mL超純水中，攪拌使其充分溶解。然后加入6 mL“1.2.1”配制的1 mg/mL Bi2S3溶液，攪拌使其充分反應，攪拌時間為1 h;

（2）用電子天平金精準稱取450 mg三氨基甲烷，放入20 mL超純水中，攪拌使其充分溶解。配制成為pH值為9.6左右的Tris緩沖液;

（3）將以上兩個步驟溶液混合，在室溫條件下充分攪拌，攪拌時間為2 h;

（4）將反應產物置于高速離心機中，在107 r/min轉速下離心洗滌3次，每次洗滌時間為10 min。然后溶解于體積一定的超純水中，配制成1 mg/mL的 Bi2S3@PDA溶液備用。

1.2.3 Bi2S3@PDA-Gd3+鈉米顆粒的合成

（1）將濃度為0.1 mol/L的GdCl3溶液100 μL，倒入10 mL質量濃度為1 mg/mL的 Bi2S3@PDA溶液中，攪拌使其混合均勻，攪拌時間為1 h;

（2）將產物置于高速離心機中，在107 r/min轉速下離心洗滌2次，然后溶于體積一定的超純水中備用。

1.3 Bi2S3@PDA-Gd3+表征

1.3.1 紫外-可見光吸收

用U-T6型紫外/可見光分光光度計測定Bi2S3和Bi2S3@PDA的紫外-可見光吸收[4]。

1.3.2 Zeta 電位

用LS-POP（9）型激光粒度儀測定 Bi2S3@PDA和Bi2S3@PDA-Gd3+的Zeta 電位和水合粒徑分布。

1.4 Bi2S3@PDA-Gd3+應用

1.4.1 體外光生成像試驗

（1）分別取質量濃度為1、0.5、0.25、0.125和0.062 5 mg/mL的Bi2S3@PDA-Gd3+溶液各200 μL，將其放入200 μL的PCR管中，超純水為空白對照組;

（2）用Nexus 128學成像儀，在800 nm 近紅外脈沖激光條件下進行光生信號測試。

1.4.2 體外磁共振T1成像試驗

（1）分別取質量濃度為400、200、100、50、25、12.5和6.25 mg/mL的Bi2S3@PDA-Gd3+溶液各200 μL。放入200 μL的PCR管中，超純水為空白對照組;

（2）用uMR 560型臨床前緊湊型磁共振成像儀進行磁共振成像試驗。

1.5 動物試驗

1.5.1 體內光學成像

在Hela 荷瘤裸鼠的尾部注射質量濃度為10 mg/mL的Bi2S3@PDA-Gd3+的PBS溶液200 μL。然后分別在注射0、2、4、8、24 h后，對Hela 荷瘤裸鼠用800 nm 近紅外脈沖激光進行光聲成像[5]。

1.5.2 體內磁共振T1成像

在Hela 荷瘤裸鼠的尾部注射質量濃度為10 mg/mL的Bi2S3@PDA-Gd3+的PBS溶液200 μL。然后分別在注射0、4、8、24 h后，對Hela 荷瘤裸鼠在T1磁場中進行磁共振成像試驗。試驗時，TR和TE分別為446 ms和15 ms。

2 結果與討論

2.1 Bi2S3@PDA-Gd3+表征分析

2.1.1 紫外-可見光吸收表征

圖1為Bi2S3和Bi2S3@PDA的紫外-可見光吸收圖，插圖a、b分別為Bi2S3和Bi2S3@PDA的水溶液圖。

由圖1可知，Bi2S3溶液表現為棕黃色;而Bi2S3@PDA的顏色則表現藍黑色。觀察圖中曲線可知，Bi2S3在近紅外區域吸收較弱;Bi2S3@PDA在近紅外區域吸收明顯的增加，且在650 nm左右出現明顯吸收峰。研究發現，堿性條件下， 用Fe3+合成的PDA會在710 nm左右出現吸收峰[7-8]。因此初步判定，Bi2S3和PDA成功復合，且Bi2S3對PDA吸收峰產生影響，使其出現藍移的現象。

2.1.2 粒徑分布和Zeta電位

圖2、圖3分別為Bi2S3、Bi2S3@PDA的粒徑分布圖和Bi2S3、Bi2S3@PDA、Bi2S3@PDA-Gd3+的Zeta電位圖。

由圖2、圖3可知，Bi2S3的平均粒徑比Bi2S3@PDA的平均粒徑低40 nm左右。Bi2S3NPs的Zeta電位為-11.65 mV;Bi2S3@PDANPs的Zeta電位為-31.89 mV、Bi2S3@PDA-Gd3+NPs的Zeta電位為-19.54 mV;Bi2S3@PDANPs的Zeta電位遠高于Bi2S3NPs的Zeta電位。這是因為在 Bi2S3外包覆著一層PDA，PDA表面具有豐富的—OH，使得Bi2S3@PDANPs表現出較強負電[9]。而Bi2S3@PDA-Gd3+的Zeta電位低于Bi2S3@PDA，這是因為和Gd3+螯合的過程中，PDA表面的—OH被消耗掉一部分，因此Bi2S3@PDA-Gd3+Zeta電位相對降低。這也就說明了Bi2S3 NPs，PDA 層和 Gd3+成功復合。

2.2 Bi2S3@PDA-Gd3+應用

2.2.1 體外光生成像

不同質量濃度的Bi2S3@PDA-Gd3+光學信號強度及其關系，具體如圖4所示。

由圖4可知，光學信號隨Bi2S3@PDA-Gd3+納米材料質量濃度的增加逐漸增加，證實Bi2S3@PDA-Gd3+納米材料與光學強度間表現出線性關系。同時，也說明了該復合材料的分散性較好，能夠用于體內光生成像。

2.2.2 體外T1磁共振成像

不同濃度的Bi2S3@PDA-Gd3+ T1磁共振成像及其關系，結果如圖5所示。

由圖5可知，Bi2S3@PDA-Gd3+納米材料在T1模式下表現出優良成像效果，且成像亮度隨Bi2S3@PDA-Gd3+濃度的增加而逐漸增強;弛豫效率r1=12.04（mmol/L）·s-1。這就證實了Gd3+離子成功螯合在PDA層上，使其成為了優秀的T1造影劑。

2.3 動物試驗

2.3.1 體內光聲成像

圖6為注射Bi2S3@PDA-Gd3+的PBS溶液后，不同時間腫瘤位置的光聲成像結果。

由圖6可知，在2 h時，腫瘤部位有光生信號，光聲強度大概為330.369 a.u.;在8 h時，光聲信號達到最高，此時強度值大概為490.424 a.u.。隨注射時間的增加，腫瘤部位的光聲信號雖然有所減弱，但仍舊具備良好的光聲信號。當注射時間為24 h時，光聲強度值為412.059 a.u;這就說明，Bi2S3@PDA-Gd3+納米材料在體內光聲成像仍舊表現良好，可用于體內光聲成像[10]。

2.3.2 體內T1磁共振成像

圖7為在T1模式下，注射Bi2S3@PDA-Gd3+的PBS溶液后不同時間腫瘤位置的磁共振圖像。

由圖7可知，T1模式下，注射Bi2S3@PDA-Gd3+的PBS溶液4 h后，體內循環使得Bi2S3@PDA-Gd3+在腫瘤位置處富集，使得該處亮度明顯增加，進而幫助確定腫瘤的位置;當注射時間超過4 h，成像效果基本未發生改變。這就說明Bi2S3@PDA-Gd3+納米材料能夠通過小鼠自身循環系統在腫瘤位置富集，且成像較為明顯，能夠成為新一代T1模式磁共振造影劑。

綜合光聲成像和T1磁共振成像結果，證實Bi2S3@PDA-Gd3+納米探針能夠為腫瘤診斷及治療都提供了更精準的技術手段。

3 結語

本文以表面自聚合方法，通過PDA的表面聚合，使其包覆Bi2S3，得到Bi2S3@PDA納米材料。然后利用PDA表面的—OH，與具有MRI性能的Gd3+金屬離子進行螯合，得到Bi2S3@PDA-Gd3+復合納米探針。通過體內外光聲試驗和T1磁共振試驗對其性能進行表征，得到具體結論。

（1）UV-vis和Zeta電位結果表明，Bi2S3@PDA比Bi2S3的近紅外區域吸收更強，且在650 nm左右出現了明顯吸收峰。Bi2S3@PDA的Zeta電位為-31.89 mV，明顯高于Bi2S3-11.65 mV，證實Bi2S3 與 PDA復合成功;而Bi2S3@PDA-Gd3+的Zeta電位為-19.54 mV，明顯低于Bi2S3@PDA的Zeta電位。說明螯合后，Gd3+離子消耗掉PDA表面—OH，表明Bi2S3、 PDA和Gd3+離子復合成功;

（2）體外光聲試驗和體外T1磁共振試驗結果表明，光聲信號強度和T1磁共振強度與Bi2S3@PDA-Gd3+濃度表現出線性關系。這就說明了Bi2S3@PDA-Gd3+納米材料具有良好的分散性，可成為優秀的T1造影劑;

（3）體內光聲試驗和體內T1磁共振試驗結果表明，小鼠尾部靜脈注射Bi2S3@PDA-Gd3+8 h后，光聲強度值最高為490.424 a.u.;注射時間為24 h時，Bi2S3@PDA-Gd3+仍具備良好的光聲信號。在T1模式下，注射4 h，Bi2S3@PDA-Gd3+在腫瘤處富集，增加腫瘤明亮度，幫助確定腫瘤的位置;超過4 h后，成像效果改變不明顯，證實Bi2S3@PDA-Gd3+納米探針能夠成為新一代T1模式磁共振造影劑。

【參考文獻】

[1] 胡雪松，衛佳楠，王洪斌，等.腫瘤微環境響應型19F-MR分子成像納米探針[J].磁共振成像，2021，12（5）：121-124.

[2] 彭嘉琪，陳明，秦安軍，等.聚集誘導發光探針用于線粒體靶向和癌細胞識別研究進展[J].發光學報，2021，42（3）：348-360.

[3] 楊克琴.胡蘿卜水熱法一步合成熒光生物質碳點用于細胞成像[J].桂林師范高等專科學校學報，2021， 35（1）：86-91.

[4] 高賀麒，焦迪，歐翰林，等.高性能聚集誘導發光納米探針用于腫瘤切除手術導航[J].化學學報，2021，79（3）：319-325.

[5] 張高瑞，張玉婷，趙雨萱，等.MnFe2O4@CNS納米探針在胰腺癌診療一體化中的價值[J].山東大學學報（醫學版），2021，59（4）：48-55.

[6] 朱麗君，張琳雪，周明璋，等.有機熒光探針輔助的近紅外熒光成像技術在宮頸癌中的應用[J].生物工程學報.2021（8）.2 678-2 687.

[7] 閆婭楠，劉洋，劉競，等.N，P-CDs用于Al3+和pH的檢測及在細胞成像中的應用[J/OL].山西大學學報（自然科學版）：1-10[2021-06-07].

[8] 李貞，劉志洪.次氯酸根激活的線粒體靶向上轉換熒光納米探針的構建[J].武漢大學學報（理學版），2021，67（1）：1-10.

[9] 楊強強，張廣智，吳芳芳，等.基于二氧化錳納米片實現let-7a向癌細胞的可視化遞送及其體外抗癌研究[J].聊城大學學報（自然科學版），2021，34（2）：42-48.

[10] 有為，田菲，張倩，等.基于SERS納米探針的細胞內硝基還原酶檢測[J].高等學校化學學報，2020，41（12）：2 742-2 748.