TTC應用于固體食品菌落總數測定研究

◎ 胡海燕

（好麗友食品（上海）有限公司，上海 201707）

固體食品如糕點類、餅干類及膨化類等產品按照國家標準方法檢測菌落總數時，稀釋后的樣品勻液中含有較多小顆粒樣品料渣或者白色油脂顆粒不能完全溶解，此樣品料渣在結果計數時呈現和乳白色菌落相似狀態，可能會被誤讀為菌落，對菌落計數有一定的干擾，影響結果的準確性。

紅四氮唑，化學名為2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-trihenylterzoliumchloride，TTC），分子式為C19H15ClN4，是一種脂溶性光敏感復合物。TTC水溶液無色，能被嗜中溫性需氧菌在新陳代謝過程中產生的琥珀脫氫酶的氫結合產生紅色的三苯甲臢（TPF），因此使菌落呈現紅色，與樣品的白色料渣明顯區分，使菌落總數計數的準確性提高[1-2]。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

紅四氮唑（TTC）：分析純，上海展云化工有限公司；菌落計數瓊脂（PCA）：北京陸橋技術股份有限公司；食鹽：中鹽上海市鹽業公司；標準菌株：ACAS-PT1080，中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心。

1.2 試驗儀器

AND-EK6100i電子秤；interscience BAGMIXER400均質器；超凈工作臺：蘇凈安泰空氣技術有限公司；GR85DA滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司；PALL過濾除菌膜：0.2 μm；賽多利斯電子單道移液器；上海博迅隔水式電熱恒溫培養箱；GZX-9240MBE博迅電熱鼓風干燥箱。

1.3 試驗方法

1.3.1 TTC制備

稱取1.0 g TTC溶解于100 mL無菌的蒸餾水中，使用0.2 μm的濾膜過濾除菌后置于經過121 ℃、15 min高壓蒸汽滅菌的玻璃瓶內，瓶外包裹錫箔紙避光保存，使用時按照所需配制成適宜的濃度進行試驗[3]。

1.3.2 試驗試劑的制備

菌落計數瓊脂（PCA）：稱取23.5 g培養基于1 L蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，121 ℃高壓滅菌15 min，冷卻至46 ℃左右備用[4]。

0.85%生理鹽水：稱取8.5 g食鹽于1 L蒸餾水中，完全溶解，121 ℃高壓滅菌15 min，冷卻至常溫備用[5]。

1.3.3 TTC顯色特征分析

已接種固定濃度細菌的奶粉和0.85%生理鹽水制成菌懸液，將菌懸液按照10倍稀釋，用均質器拍打2 min制成樣品勻液，然后按照1∶10、1∶100進行梯度稀釋，每個梯度做2個平行，共做8組，最后分別用含有0%、0.000 4%、0.001 0%、0.002 0%、0.004 0%和0.008 0%TTC的菌落計數瓊脂傾注平板，凝固后倒置于（36±1）℃培養24 h后觀察菌落形態。

1.4 TTC使用濃度分析

1.4.1 不同濃度TTC應用于糕點類產品的菌落總數檢測

分別準備含有不同菌量的糕點類制品，即糕點1、糕點2和糕點3。將以上樣品均按照10倍稀釋溶解，用均質器拍打2 min制成樣品勻液，然后分別按照梯度稀釋1∶10、1∶100進行試驗，每個樣品及試驗梯度做兩個平行。最后分別用不含TTC的PCA和分別含有0.000 1%、0.000 5%、0.001 0%、0.001 5%和0.002 0%TTC的PCA培養基進行傾注平板，待平板凝固后倒置于細菌培養箱內，（36±1）℃下培養24 h，對平板上菌落進行計數[6]。

1.4.2 不同濃度TTC應用于餅干制品的菌落總數檢測

分別準備含有不同餅干類制品，即餅干1、餅干2和餅干3。將以上樣品均按照10倍稀釋溶解，用均質器拍打2 min制成樣品勻液，然后分別按照梯度稀釋1∶10、1∶100、1∶1 000進行試驗，每個樣品及試驗梯度做2個平行。最后分別用不含TTC的PCA和分別含有0.000 1%、0.000 5%、0.001 0%、0.001 5%和0.002 0%TTC的PCA培養基進行傾注平板，待平板凝固后倒置于細菌培養箱內，（36±1）℃下培養24 h，對平板上菌落進行計數[6]。

1.4.3 TTC最佳使用濃度分析

配制不同濃度的菌懸液3份，分別使用未添加TTC和添加了0.001%、0.002%、0.003%、0.004%和0.005%的菌落計數瓊脂進行檢測，對每個樣品的結果進行分析，選擇TTC的最佳使用濃度。

1.5 TTC應用于不同類型產品菌落總數檢測

分別準備含有不同菌量的糕點產品、餅干產品。將以上樣品均按照10倍稀釋溶解，用均質器拍打2 min制成樣品勻液，然后分別按照梯度稀釋1∶10、1∶100進行試驗，每個樣品及試驗梯度做2個平行。最后分別用不含TTC的PCA和含有0.001%TTC的PCA培養基進行傾注平板，待平板凝固后倒置于細菌培養箱內，（36±1）℃下培養24 h，對平板上菌落進行計數，并觀察菌落形態。

為驗證TTC添加使用時結果檢測的準確性，對菌落總數檢測是否具有抑菌效果，采用中國檢科院測試評價中心提供的能力驗證標準菌進行對比試驗，標準菌用0.85%生理鹽水稀釋后采用1∶10、1∶100、1∶1 000等梯度稀釋，最后分別傾注不含TTC和含有0.001%TTC的PCA培養基進行試驗，待樣品凝固后倒置于細菌培養箱，（36±1）℃下培養24 h，對平板上菌落進行計數，并觀察菌落形態。

2 結果與分析

2.1 TTC顯色特征分析

未添加TTC的平板上菌落呈現白色至淡黃色，奶溶液中的菌落呈蔓延狀態，無論是奶溶液還是生理鹽水中，菌落顏色隨著菌落計數瓊脂中TTC的濃度增加，逐漸由淡紅色變為深紅色；隨著添加濃度的增加，顯色效果越明顯，使菌落更易辨認，如圖1、圖2所示。

圖1 菌落在奶粉中不同濃度TTC顯色狀態圖

圖2 菌落在生理鹽水中不同濃度TTC顯色狀態圖

2.2 TTC使用濃度分析

3個糕點樣品和3個餅干樣品菌落總數結果均顯示，未添加TTC和添加0.000 1%TTC的檢測結果偏低，而添加0.001 0%～0.002 0%TTC的檢測結果明顯偏高，如表1所示。

表1 不同樣品添加不同濃度TTC檢測結果對比表（單位：CFU·g-1）

通過平板對比得到，未添加TTC的菌落形態和樣品料渣極為接近，計數時易漏讀或誤把料渣計為菌落，尤其餅干類樣品菌落蔓延較大，影響計數的準確性。添加0.000 1%TTC的平板菌落亦呈白色，隨著TTC添加濃度的增加，菌落由粉紅色逐漸顯色至深紅色，和白色的產品料渣形成鮮明對比，較易區分，如圖3所示；餅干類樣品隨著TTC添加濃度的增加，菌落蔓延現象逐漸減少，菌落呈現清晰的紅色狀態，極易區分和計數，如圖4所示。

圖3 糕點樣品添加不同濃度TTC菌落形態對比圖

圖4 餅干樣品添加不同濃度TTC菌落形態對比圖

由不同TTC濃度檢測結果可得，當添加濃度低于0.001 0%時菌落亦蔓延，菌落顯色不佳，不便于計數，而當TTC濃度為0.001 0%～0.002 0%時菌落顯色明顯，便于計數，且對菌落的生長無明顯抑制作用。

由TTC最佳使用濃度分析試驗可得，不添加TTC時，菌落蔓延明顯，菌落有重疊現象，檢測結果明顯低于添加TTC；而TTC的添加量為0.001%～0.003%時，檢測結果較為穩定，但TTC添加量為0.004%～0.005%時，檢測結果明顯偏低，如圖5所示。說明當TTC添加濃度≤0.003%時，對菌落總數檢測無抑菌作用，當添加濃度≥0.004%時有明顯的抑菌作用。

圖5 不同濃度TTC下菌落總數檢測結果圖

2.3 TTC應用于不同類型產品菌落總數檢測

如圖6、圖7所示，糕點產品或餅干產品稀釋后均存在不同顆粒度的料渣或者油脂，培養后的菌落一般呈現白色或淡黃色，和部分料渣極為相似，菌落計數瓊脂中未添加TTC時，不易區分料渣顆粒和菌落，導致計數結果偏低，而使用添加0.001%的TTC作為顯色劑時，能明顯區分紅色菌落，使菌落計數準確度更高。對比添加與未添加顯色劑的樣品菌落總數來看，含有樣品渣的固體檢樣添加TTC顯色劑后，檢測結果明顯偏高，而未添加TTC的檢測結果偏低。同時，用標準菌樣本對含有0.001%TTC的顯色能力進行驗證，發現添加0.001%TTC對結果無明顯抑制作用，如表2所示。

表2 不同樣品不添加TTC和添加TTC檢測結果對比表

圖6 糕點樣品未添加TTC和添加TTC對比圖

圖7 餅干產品未添加TTC和添加TTC對比圖

3 結論與討論

3.1 結論

對TTC的顯色特性進行分析，TTC可以使活菌菌落呈現紅色，且添加濃度越高，菌落紅色越明顯，且能有效抑制菌落蔓延。

使用不同濃度TTC檢測糕點、餅干樣品菌落總數時，由于菌落呈紅色，與產品白色或淡黃色料渣對比鮮明，相比不含TTC的培養基，菌落計數更加方便，當TTC使用濃度＜0.001 0%時菌落偏小，且易蔓延，不便于計數，但使用濃度0.001 0%～0.002 0%時，菌落形態偏大，能有效減少蔓延菌落。故0.001 0%～0.002 0%的TTC添加量使用于固體樣品的檢測，能顯著區分菌落和料渣，避免誤讀，提高菌落總數檢測的準確性。

在固體樣品，如糕點、膨化及餅干樣品檢測中，有明顯料渣或油脂顆粒的菌落總數檢測中，TTC的使用可以明顯區分菌落和料渣。同時，在用標準菌進行對比試驗得到，添加使用0.001%的TTC，對菌落總數檢測無抑制作用，即在該濃度下菌落能夠很好地顯色，同時又不會對菌落總數產生顯著性的差異；通過進一步使用濃度分析得到，TTC添加量≤0.003%時，對菌落總數的檢測無影響。

3.2 應用與探討

使用TTC時，明顯看出在糕點產品檢測時較少蔓延現象，而在餅干檢測中較多蔓延菌落，因此TTC在糕點類產品和餅干類產品中的抑菌效果是否相同需要進一步分析。TTC應用于不同樣品的檢測，如水、環境涂抹檢測、調味料等呈現的菌落形態均不同，在水中菌落生長慢，即使添加TTC，培養48 h菌落較??；而環境涂抹中部分菌落無法被TTC染色，故不同菌落在使用TTC顯色時呈現不同狀態，需要進一步分析研究。