UPLC-MS法測(cè)定動(dòng)物源性食品中12種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留量

◎ 賈琳斐，管 理，賈潤(rùn)芳，尹 靜，張 鑫

(咸陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，陜西 咸陽(yáng) 712000)

大環(huán)內(nèi)酯類藥物是一類快速抑制蛋白質(zhì)合成的抑菌藥，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌具有良好的抗菌作用[1-2]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在臨床上常用于上呼吸道感染、泌尿道感染的治療[3-4]，少量使用能促進(jìn)畜禽類的生長(zhǎng)，故廣泛應(yīng)用于獸藥領(lǐng)域[5]。

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素檢測(cè)方法主要有紫外分光光度法[6]、毛細(xì)管電泳-電化學(xué)法[7]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9]。其中，紫外分光光度法、毛細(xì)管電泳-電化學(xué)法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因靈敏度、準(zhǔn)確度均較低及被檢樣品種類受限等原因，研究鮮有報(bào)道。目前，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的主要檢測(cè)手段，前處理技術(shù)多采用QuEChERS法[10]或固相萃取法[11]，但這些方法或檢出限較高、或大環(huán)內(nèi)酯類檢測(cè)種類較少。本研究選取具有代表性的12種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，通過對(duì)提取條件、基質(zhì)效應(yīng)的影響進(jìn)行分析，為動(dòng)物源性食品中多種大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留的快捷、準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈，色譜純，默克公司；HLB固相萃取柱（500 mg/6 mL）、C18色譜柱（500 mg /3 mL），均為艾杰爾公司；12種大環(huán)內(nèi)酯類標(biāo)準(zhǔn)品均由CATO公司提供；動(dòng)物源性樣品均來自咸陽(yáng)市區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)及大型超市，取可食部分絞碎、混勻，-20 ℃冷凍保存。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀Qsight 210，美國(guó)PerKin Elmer公司；RV-10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)IKA公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取適量12種大環(huán)內(nèi)酯類標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，得到濃度為100 μg·mL-1的大環(huán)內(nèi)酯類標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，冷凍保存。分別移取適量的各單標(biāo)儲(chǔ)備溶液，空白基質(zhì)稀釋，配制成大環(huán)內(nèi)酯類標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品處理

提取：稱取均質(zhì)后的試樣5 g，于50 mL塑料離心管中，加入20 mL 1%酸化乙腈，渦旋1 min，超聲5 min，5 000 r·min-1離心6 min，取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，殘?jiān)偌?5 mL乙腈，重復(fù)提取一次，合并上清液，備用。凈化：預(yù)先用5 mL乙腈活化HLB固相萃取柱，上清液過柱，收集洗脫液，加入異丙醇4 mL，40 ℃蒸發(fā)至干；加入2 mL乙腈乙酸銨（1∶4）溶解殘余物，加乙腈飽和正己烷2 mL，轉(zhuǎn)至離心管中，旋渦 10 s，5 000 r·min-1離心 5 min，取下層清液過0.22 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流速：0.3 mL·min-1；流動(dòng)相：A為5 mmol·L-1乙酸銨，B為0.1%甲酸乙腈；梯度洗脫：0～2 min，A∶B為95∶5；2～5 min，A∶B為 50∶ 50；5～ 6 min，A∶B為5∶ 95；6～8 min，A∶B為5∶95；8.0～8.3 min，A∶B為95∶5；8.3～11.0 min保持95∶5。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple Reaction Monitoring，MRM），干燥器流速：100 μL·min-1；脫溶劑氣溫度：300 ℃；霧化器流速：200 μL·min-1；離子源噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：300 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

為提高提取效率，本研究比較了乙腈、1%酸化乙腈、乙腈-乙酸乙酯（體積比1∶1）對(duì)動(dòng)物源食品中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素藥物殘留的提取效果，圖1結(jié)果表明，采用乙腈、乙腈-乙酸乙酯（體積比1∶1）提取液提取目標(biāo)物質(zhì)后回收率較低，回收率在20%～60%；1%酸化乙腈對(duì)12種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的提取效率最高，回收率均在60%以上。

圖1 3種溶劑對(duì)12種化合物回收率的影響圖

2.2 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)與消除

對(duì)于動(dòng)物源性等較復(fù)雜樣品，基質(zhì)效應(yīng)影響樣品測(cè)定的準(zhǔn)確性。因此，在樣品測(cè)定時(shí)應(yīng)建立基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effect，ME）的評(píng)價(jià)，一般較為簡(jiǎn)單的評(píng)價(jià)方法為相對(duì)響應(yīng)值法，A為空白樣品基質(zhì)中添加的相同含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的響應(yīng)值，B為純?nèi)軇┲袠?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的響應(yīng)值，ME=A/B×100%，當(dāng)ME＜1.0時(shí)，則存在基質(zhì)抑制效應(yīng)；當(dāng)ME＞1.0時(shí)，則存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)[12]。表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，12種化合物在3種不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)在0.16～1.31。其中，3種基質(zhì)對(duì)交沙霉素，雞肉對(duì)克拉霉素、林可霉素均無明顯的基質(zhì)效應(yīng)（ME=1±0.1）；豬肉對(duì)克拉霉素、林可霉素均有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，3種基質(zhì)對(duì)其余化合物均有基質(zhì)抑制作用。

表1 12種大環(huán)內(nèi)酯類在不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)表

消除基質(zhì)效應(yīng)的方法包括改進(jìn)前處理凈化方法、同位素內(nèi)標(biāo)法、基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線法，綜合考慮，本研究采用基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線法，能夠很好地消除基質(zhì)效應(yīng)，滿足殘留物的檢測(cè)。

2.3 檢出限與定量下限

采用空白樣品配制與待測(cè)樣品相同基質(zhì)的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為 2 ng·mL-1、4 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、40 ng·mL-1、50 ng·mL-1、80 ng·mL-1和100 ng·mL-1，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，外標(biāo)法定量。結(jié)果顯示，各化合物均在2～100 ng·mL-1濃度線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.99。以3倍的信噪比確定檢出限，10倍的信噪比確定定量下限，得到12種大環(huán)內(nèi)酯類化合物的檢出限均為 0.1 μg·kg-1，定量下限均為 0.3 μg·kg-1。

2.4 回收率與精密度

準(zhǔn)確稱取陰性試樣豬肉、雞肉、牛肉并按照1.3.2的樣品前處理方法進(jìn)行回收率及精密度的考察。向其中加入 0.3 μg·kg-1、0.6 μg·kg-1、3.0 μg·kg-13 種不同濃度進(jìn)行3個(gè)梯度加標(biāo)水平的回收率測(cè)定，每個(gè)添加水平測(cè)6個(gè)平行樣品。基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量測(cè)定，計(jì)算平均回收率和精密度，結(jié)果見表2。12種抗生素的平均回收率為69.2%～105.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在9.5%以內(nèi)。該方法精密度、回收率均滿足痕量實(shí)驗(yàn)分析要求。

表2 12種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的加標(biāo)平均回收率及精密度表

2.5 實(shí)際樣品的分析

應(yīng)用本方法對(duì)咸陽(yáng)市區(qū)大型超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)抽檢的豬肉、雞肉、牛肉各20批進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，1批次豬肉檢出紅霉素，殘留量為8.2 μg·kg-1，其余樣品均未檢出上述12種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留物。

3 結(jié)論

本研究通過對(duì)提取條件的優(yōu)化、基質(zhì)效應(yīng)的影響分析，建立了超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)動(dòng)物源性食品中的12種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留量的方法；得到12種大環(huán)內(nèi)酯類化合物的檢出限均為0.1 μg·kg-1及定量下限均為0.3 μg·kg-1。12種抗生素的平均回收率為69.2%～105.3%，精密度均在9.5%以內(nèi)。本方法易操作，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，滿足批量檢測(cè)動(dòng)物源性食品中的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的需求。