液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法檢測蝦中四環(huán)素

◎ 包東東，唐 波，田 鋒，譚慧林

（阿克蘇地區(qū)食品安全檢測中心，新疆 阿克蘇 843000）

四環(huán)素類藥物（Tetracyclines，TCs）是一種天然或半人工合成藥物，能抑制和殺死多種革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、衣原體、支原體等致病微生物。四環(huán)素類藥物種類很多，有20余種，見的較多的有四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、金霉素（Chlortetracycline，CTC）和土霉素等。在畜牧業(yè)養(yǎng)殖中，由于四環(huán)素類藥物價(jià)格偏低、抗菌效果顯著，被廣泛用于動(dòng)物疾病防治中。因此，四環(huán)素類藥物的消耗量占動(dòng)物疫情防控的總藥量偏高，其中歐盟約為46%，美國約為15.8%。四環(huán)素藥物的過量使用，導(dǎo)致動(dòng)物源性食品和環(huán)境中四環(huán)素類藥物殘留較高。消費(fèi)者長期食用四環(huán)素類藥物殘留超標(biāo)的食品，可出現(xiàn)牙齒變黃、過敏反應(yīng)、肝臟損傷、腸道紊亂等不良反應(yīng)，部分動(dòng)物源性食品中所含的四環(huán)素類等抗生素被食用后會(huì)造成機(jī)體發(fā)生過敏反應(yīng)，部分患者可能出現(xiàn)蕁麻疹、急性血管性水腫、休克甚至死亡；部分藥物在被人體食用后還會(huì)誘發(fā)基因突變，引發(fā)“三致作用”，有的還可導(dǎo)致體內(nèi)細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)。四環(huán)素較穩(wěn)定，可經(jīng)尿、糞便排向外界環(huán)境，會(huì)引起環(huán)境污染，環(huán)境中藥物殘留可導(dǎo)致微生物耐藥性增強(qiáng)，出現(xiàn)新的耐藥菌株，給公共衛(wèi)生造成危害。因此，加強(qiáng)動(dòng)物源性食品四環(huán)素類藥物及其代謝物檢測，對保障公共衛(wèi)生安全具有重要意義[1]。

檢測四環(huán)素藥物殘留的方法有儀器分析法、免疫學(xué)法、微生物法、生物傳感器等，其中被廣泛應(yīng)用于檢驗(yàn)分析的主要是儀器分析法和免疫學(xué)法。免疫學(xué)法由于操作簡單、檢測速度快、成本低、對檢驗(yàn)人員專業(yè)要求不嚴(yán)格等優(yōu)點(diǎn)多用于現(xiàn)場快速檢測及樣品初篩[2]。與免疫學(xué)法相比，儀器分析法具有結(jié)果準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，并可實(shí)現(xiàn)對多類藥物的快速定量檢測，被用于藥物殘留檢測和確證。高效液相色譜法及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是最常用的儀器分析法。

為確保本實(shí)驗(yàn)室檢測動(dòng)物源性食品中四環(huán)素殘留的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)室參加了中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院組織的蝦中四環(huán)素檢測能力驗(yàn)證，樣品編號為7-F701，17-T228。本實(shí)驗(yàn)室通過利用能力驗(yàn)證這種外部質(zhì)量保證工具，識(shí)別與同行機(jī)構(gòu)之間的差異，補(bǔ)充內(nèi)部質(zhì)量控制技術(shù)，為自身的持續(xù)改進(jìn)和質(zhì)量管理提供信息[3]。此次能力驗(yàn)證可判斷實(shí)驗(yàn)室和檢查機(jī)構(gòu)等是否具有從事校準(zhǔn)/檢測活動(dòng)的能力，以及監(jiān)控能力的持續(xù)狀況，不斷提升檢驗(yàn)檢測能力，打造重點(diǎn)綜合性實(shí)驗(yàn)室。本實(shí)驗(yàn)室采用了常用的檢測方法《動(dòng)物源性食品中四環(huán)素類獸藥殘留量檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法與高效液相色譜法》（GB/T 21317—2007）進(jìn)行檢測。在此次能力驗(yàn)證中，利用現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備對標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行了優(yōu)化，最終取得了滿意結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦粉樣品：中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院能力驗(yàn)證樣品，樣品1編號為17-F701，樣品2編號為17-T228。

四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品，1 000 mg·L-1，農(nóng)業(yè)部保護(hù)科研監(jiān)測所；檸檬酸，分析純，上海埃彼化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鈉，分析純，天津恒信試劑廠；乙酸乙酯，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙二胺四乙酸二鈉，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲酸，色譜純，純度≥88%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；甲醇、乙腈，色譜純，純度99.9%，德國Merk公司；HLB固相萃取柱，60 mg/3 mL，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；緩沖溶液：將1 000 mL 0.1 mol·L-1磷酸二鈉溶液與625 mL 0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液混合；Na2EDTA-McLLvaine緩沖溶液：秤取60.5 g乙二胺四乙酸二鈉放入1 625 mL McLLvaine緩沖溶液，使其溶解，搖勻。三氟乙酸溶液10 mmol·L-1。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平，感量0.01 g（梅特勒托利多）；液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀配有電噴霧（ESI）源（賽默飛世爾儀器公司）；超聲清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；低溫離心機(jī)，最高轉(zhuǎn)速5 000 r·min-1，控溫范圍為-40 ℃至室溫（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司）；J2固相萃取儀（美國J2 Scientific）；氮吹儀（北京同泰聯(lián)科技發(fā)展）；渦旋儀（法國梅里埃）；pH計(jì)，測量精度±0.02（上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 mg·L-1），按照 10倍稀釋梯度，分別配制成 0.02 mg·L-1、0.05 mg·L-1、0.10 mg·L-1、0.20 mg·L-1、0.30 mg·L-1和 0.50 mg·L-1一系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，密封待用。

1.3.2 檢測方法

試樣中的四環(huán)素殘留用0.1 mol·L-1Na2EDTAMcLLvaine緩沖溶液（pH=4.0）提取，經(jīng)過濾、高速離心后，上清液經(jīng)HLB固相萃取柱凈化，進(jìn)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)儀測定，外標(biāo)峰面積法定量。

稱取蝦粉樣品3.00 g，加水復(fù)原至6 g，倒入50 mL聚丙烯離心管中，分別用約20 mL、20 mL、10 mL 0.1 mL·L-1Na2EDTA-McLLvaine緩沖溶液冰水浴超聲提取3次，每次渦旋混合1 min，超聲提取10 min，3 000 r·min-1離心5 min（溫度低于15 ℃），合并上清液，定容至50 mL，混勻，5 000 r·min-1離心10 min（溫度低于15 ℃），過濾，吸取10 mL濾液，過活化后的HLB固相萃取柱，樣液流完后，用5 mL水和5 mL甲醇+水（1+19，V/V）淋洗，用固相萃取儀吹干，再用10 mL甲醇+乙酸乙酯（1+9，V/V）洗脫，將濃縮液用氮吹儀吹干，用1 mL甲醇+三氟乙酸（1+19，V/V）溶液溶解殘?jiān)^0.22 μm濾膜，上機(jī)測定。

1.4 儀器條件及測定方法

1.4.1 液相及質(zhì)譜條件

液相條件：色譜柱WATERS UPLC C8-3柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 +10 mmol·L-1三氟乙酸溶液（1+19，V/V）；流速：200 μL·min-1；柱溫度：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜儀離子化模式：電噴霧電離正離子模式（ESI+）；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；分辨率：單位分辨率；碰撞氣：20 L·h-（1氬氣）；去溶劑氣：500 L·h-1（氮?dú)猓浑x子源溫度：350 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)化

樣品凈化使用了HLB固相萃取柱、C18固相萃取柱，實(shí)驗(yàn)表明，HLB固相萃取柱吸附容量是鍵合硅膠固定相的3～10倍[4]，可達(dá)到較好的凈化效果，因此選用HLB固相萃取柱為樣品凈化柱。考慮到液質(zhì)方法中流動(dòng)相為乙腈+水（1∶9，含0.2%甲酸）溶解，所以將標(biāo)準(zhǔn)溶液及前處理濃縮后殘?jiān)?0%乙腈與90%水進(jìn)行溶解，其中水相含0.2%甲酸溶液，溶解后必須充分混勻。

2.2 液質(zhì)聯(lián)用儀質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.2.1 液相色譜條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中流動(dòng)相使用了不同流速對液相色譜進(jìn)行優(yōu)化，分別使用 0.1 mL·min-1、0.2 mL·min-1、0.3 mL·min-1流速作為流動(dòng)相；使用不同柱溫（30 ℃、35 ℃、40 ℃）、不同柱長的WATERS UPLC C8-3柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）和WATERS UPLC C8-3柱（150 mm×10 mm，5 μm）分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。實(shí)驗(yàn)表明，0.2 mL·min-1流速符合實(shí)驗(yàn)條件，同時(shí)可達(dá)到減少試劑使用量、廢液排出量等實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?5 ℃柱溫條件下四環(huán)素藥物分離效果良好，峰形良好；色譜柱選用WATERS UPLC C8-3柱（100 mm×2.1 mm，5 μm），出峰時(shí)間提前0.5 min，且售價(jià)更加便宜。最終選擇0.2 mL·min-1的流速、柱溫35 ℃、WATERS UPLC C8-3柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）為最佳色譜分離條件。

2.2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

有研究表明，四環(huán)素藥物易溶于有機(jī)溶劑，如乙腈、甲醇、丙酮、三氯甲烷等。實(shí)驗(yàn)中，一般選擇甲醇、乙腈作為色譜流動(dòng)相，在液相色譜質(zhì)譜中乙腈的分離效果優(yōu)于甲醇。在流動(dòng)相中加入少量的酸可以提高電離效應(yīng)、改善峰形。GB/T 21317—2007以三氟乙酸作為酸化試劑，但三氟乙酸對質(zhì)譜信號有抑制作用，在使用過程中會(huì)殘留在離子通道及離子源中，污染儀器管路，使柱壓增高，降低儀器壽命，而在液相質(zhì)譜中常使用甲酸作為流動(dòng)相，使目標(biāo)物分離效果好，污染少，有利于質(zhì)譜儀的長期使用，因此選擇甲酸作為酸化試劑[5-6]。

實(shí)驗(yàn)中配制了0.1%、0.2%、0.3%及0.4%濃度的甲酸水溶液，分別和乙腈組成流動(dòng)相，將四環(huán)素目標(biāo)物注入質(zhì)譜儀，查看離子化效率。結(jié)果表明，甲酸濃度增高，液相質(zhì)譜儀離子源靈敏度也隨之增高，考慮到甲酸溶液的濃度過高，對儀器泵、管路及離子源帶來損壞，而0.2%甲酸溶液已能滿足該實(shí)驗(yàn)分離需要，峰形較好，無拖尾現(xiàn)象，因此選擇0.2%甲酸水溶液作為最終流動(dòng)相。

將10 mg·L-1四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜儀中，在MS Scan模式下，得到母離子相應(yīng)碎片，在Daughter Scan模式下，得到子離子相應(yīng)的碎片；在MSMS模式下，優(yōu)化錐孔電壓和碰撞能量，優(yōu)化后的母離子、子離子、碰撞電壓及錐孔電壓參數(shù)為母離子445.1m/z，子離子428.1m/z（定量離子）、154.1m/z，碰撞電壓28 V，錐孔電壓22 V。

2.3 檢測結(jié)果分析

2.3.1 曲線線性關(guān)系及儀器檢出限

以峰面積對應(yīng)的濃度進(jìn)行線性回歸，線性方程為y=6 226.16x-11.917 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 914。根據(jù)四環(huán)素化合物的定性離子的重構(gòu)色譜峰的信噪比≥3，定量離子的重構(gòu)色譜峰的信噪比≥10，通過計(jì)算，得出儀器檢出限為 1 μg·kg-1，儀器定量限為 5 μg·kg-1。

2.3.2 回收率及精密度

分別取17-F701蝦粉、17-T228蝦粉樣品各3.00 g，在樣品中分別添加0.1 mg·L-1四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用液1.00 mL，按照上述方法操作上機(jī)測定，計(jì)算6組濃度的回收率及精密度，結(jié)果見表1。

表1 方法回收率及精密度結(jié)果表

2.3.3 樣品與加標(biāo)回收色譜圖

分別將處理好的樣品與加標(biāo)樣品在上述條件下進(jìn)行測定，得到樣品與加標(biāo)回收色譜圖，見圖1。

圖1 樣品與加標(biāo)回收色譜圖

2.4 數(shù)據(jù)分析

蝦粉樣在考慮回收率的情況下，計(jì)算出17-F701蝦粉樣四環(huán)素含量為94.0 μg·kg-1，17-T228蝦粉樣四環(huán)素含量為124.0 μg·kg-1，對17-F701蝦粉樣做重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.8%。對17-T228蝦粉樣做重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.4%。

3 結(jié)論

通過此次能力驗(yàn)證，本實(shí)驗(yàn)室充分利用現(xiàn)有資源，按照《動(dòng)物源性食品中四環(huán)素類獸藥殘留量檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法與高效液相色譜法》（GB/T 21317—2007）進(jìn)行處理，并對前處理方法、色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，最終選擇0.2 mL·min-1的流速、柱溫35 ℃、WATERS UPLC C8-3（100 mm×2.1 mm，5 μm）色譜柱為最佳色譜分離條件。配制不同濃度四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測試，并求出回歸方程，線性良好，R2=0.998 914。對比空白蝦樣和添加四環(huán)素的蝦樣，差異明顯，對回收率和精密度進(jìn)行分析，回收率為85%～103%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.8%～9.4%。能力驗(yàn)證顯示17-F701蝦粉樣品Z值為+1.1，17-T228蝦粉樣品Z值為+0.8，均達(dá)到滿意結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)化后該方法可以達(dá)到準(zhǔn)確的分析效果，更加節(jié)約檢測時(shí)間和檢測成本，適用于蝦中四環(huán)素類藥物的測定。