非酒精性脂肪肝與骨質疏松間的生物信息學關系

于洪杰 譚國慶

1.滄州市人民醫院，河北 滄州 061000 2.山東中醫藥大學附屬醫院脊柱骨科，山東 濟南 250014

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是極少酒精作用下發生的超過5 %的肝細胞脂肪變性，屬代謝應激性肝損傷，已經成為主要公眾健康問題之一[1]。其具體發病機制目前尚未明確，但普遍認為與胰島素抵抗、氧化應激和脂質過氧化有關[2-3]。但隨著研究的不斷深入，越來越多證據表明肝臟與骨之間有著復雜聯系，NAFLD更是能夠通過多條通路影響骨骼發育成熟，臨床研究表明NAFLD患者的腰椎、髖部等部位的BMD明顯下降[4]。同時NAFLD與絕經后女性骨密度關系更為緊密，Lee等[5]經過回顧性橫斷面研究分析認為NAFLD是絕經婦女骨質疏松的高危因素。因此NAFLD與骨質疏松(OP)之間有復雜的聯系, 且兩者之間相互影響。本研究依據生物信息相關技術方法探討非酒精性脂肪肝病與骨質疏松之間的可能作用機制。

1 材料和方法

分別以骨質疏松及非酒精性脂肪肝為關鍵詞在相關疾病數據庫( Disgenet、TTD、OMIM、Drugbank、Genecards)中篩選相關靶點，其中Disgenet篩選評分≥0.3 ，Genecards篩選相關度≥5。將兩組基因通過uniprot數據庫轉換成uniprot ID進行去重整合，獲得已明確的疾病靶點。然后將兩組靶點映射取得韋恩圖，將得到的關鍵靶點通過string數據庫制作靶點間相互作用PPI網絡。將PPI網絡TSV格式導進Cytoscape3.7.2，篩選節點連接度(degree)制作核心靶點圖。通過基因功能注釋DAVID 數據庫進行GO(Gene Ontology)生物過程富集分析以及 KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析使基因信息可視化，分別將篩選出的前20個GO條目與KEGG條目，依據Omicshare云平臺制作高級氣泡圖。

2 結果

經過基因庫搜索、轉換ID整合后共選出與骨質疏松癥和非酒精性脂肪肝相關基因 875 個和952個。映射出關鍵靶點217個，生成韋恩圖(見圖1)。經string數據庫在0.7高信度下生成相互作用PPI網絡(見圖2)，其中有202個節點，208個靶點間具有1 280條相互作用關系。平均節點連接度(degree)為17.6，以篩選節點連接度(degree)≥36篩選到核心靶點24個(如圖3)，所獲核心靶點均直接或間接影響非酒精性脂肪肝與骨質疏松。經DAVID 數據庫獲得78項GO富集結果(P<0.05)及78條KEGG信號通路(P<0.05)，以P值升序排列，分別篩選出符合條件的20個生物過程和信號通路，并將其以氣泡圖的形式展現出來(見圖4、圖5)。通路下所含靶點分別見表1。

圖1 非酒精性脂肪肝與骨質疏松映射關鍵靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of key targets for NAFLD and osteoporosis mapping

圖3 核心靶點圖(核心靶點大小為degree大小)Fig.3 Diagram of the core target (the size of the core target is degree size)

圖4 GO富集分析氣泡圖(前20條)Fig.4 Bubble diagram of GO enrichment analysis (first 20)

圖5 KEGG通路分析氣泡圖(前20條)Fig.5 Bubble diagram of KEGG pathway analysis (first 20)

表1 KEGG通路下所含靶基因(前20條)Table 1 Target genes contained in KEGG pathway (first 20)

3 討論

經過相關基因數據庫查重整合后發現NAFLD和OP均含有大量基因靶點，更說明這是兩種相對復雜的代謝性疾病，且在PPI相互作用網絡0.7高信度下具有1 780條相互作用關系，眾多靶基因間具有復雜的相互作用關系使兩種疾病發生密切聯系，其中白介素6(IL-6)、胰島素(INS)、 血管內皮生長因子(VEGFA)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)、腫瘤壞死因子(TNF)等核心靶點可能是兩者相互影響的重要節點。IL-6、TNF是生物學效應廣泛的細胞炎性因子，絕經后婦女體內雌激素水平下降，導致雌激素抑制成骨細胞生成TNF-α能力減弱，TNF-α的增加進一步刺激成骨細胞產生IL-6，發揮抑制成骨、促進破骨的作用[6]。IL-6、TNF-α等促炎因子的分泌導致NAFLD容易進展成為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)[7]。有研究[8]認為NAFLD患者存在腸道菌群紊亂、致病菌增多等情況，引起體內炎癥反應，使IL-6、TNF-α等促炎因子水平升高，誘發骨質疏松。促炎性細胞因子是NASH病理的重要介質，研究證實NASH患者中IL-6水平升高，且除參與炎癥作用外，IL-6、TNF-α等還通過胰島素抵抗、脂質代謝參與NASH的發生發展[9]。INS在骨質疏松進程中具有重要作用，一方面作用于成骨細胞表面受體，上調成骨細胞活性；另一方面調節血糖水平，抑制高糖對成骨細胞的毒性作用[10]。胰島素主要調節體內糖脂代謝，高糖除增加TNF-α、IL-6的表達外，胰島素抵抗引起代謝障礙產生脂肪積累，肝細胞內過度脂肪積累通過炎癥應激等過程導致糖脂毒性，引起脂肪變性最終誘發NAFLD[11]，因此NAFLD常伴有肥胖、糖尿病等并發疾病。有研究[12]顯示缺氧對大鼠成骨細胞的骨形成能力起到抑制作用，VEGFA能夠調控血管內皮細胞的增殖和分化，增加小靜脈血管與微血管的通透性[13]，從而增加供氧，緩解缺氧狀態。同樣血管構建也伴隨在NAFLD的發生發展過程，肝竇毛細血管化是NAFLD的早期形態學變化[14]，因此通過靶向抑制肝竇脈細血管內生成有助于延緩NAFLD發展。有關數據表明, VEGF對于肝臟內血管形成及肝內皮細胞增殖有調控作用[15]，因此針對性抑制VEGFA有助于促進NAFLD的良好預后。推測NAFLD臨床治療過程中可能選擇性的抑制VEGFA的表達，加重了體內缺氧環境，導致成骨能力減弱，促進OP的發生發展。PI3K/Akt信號通路是參與骨質疏松的經典通路之一，TAK1是其下游重要靶激酶，在骨形成中發揮重要作用。有研究[16]發現, 地塞米松能夠間接活化TAK1誘導成骨細胞及骨細胞的凋亡, 而TAK1抑制劑能夠抑制這種作用。AKT還是胰島素發揮生物學功能的作用底物，促進脂肪、肝臟等對葡萄糖的攝取[17]。AKT磷酸化可以有效調節糖脂代謝改善胰島素抵抗，胰島素抵抗在NAFLD進程中具有重要作用。綜上所述，骨質疏松與非酒精信號脂肪肝具有緊密聯系，眾多核心靶點主要圍繞炎性反應及糖脂代謝等相關生理過程，這可能是二者發生聯系的相關內在機制。

通過核心靶點富集分析可以發現諸多靶點通過調控多條通路發揮作用，其中主要在于乙肝通路、類風濕關節炎通路、TNF通路、IBD通路等多條信號通路。乙肝是臨床常見具有傳染性慢性肝病之一，當合并其他代謝性疾病是會增加NAFLD風險。有研究認為乙型肝炎和NAFLD具有協同作用，可加重肝臟損傷，因此預防二者協同作用具有重要意義[18]。而骨質疏松作為乙肝的常見并發癥越來越受到重視，一項36 146例乙肝患者臨床資料總結研究發現，乙肝患者骨質疏松率高于對照組1.13倍[19]，其作用機制除傳統核因子-κβ受體活化因子配體-核因子-κβ受體活化因子-護骨素系統外，還可通過鈣磷代謝、炎癥反應等影響骨質疏松的發生[20]。類風濕性關節炎是一種自身免疫性疾病，一項隊列研究發現類風濕性關節炎與肝臟疾病相關，特別是非酒精性脂肪肝[21]，其作用機制可能與炎癥反應有關。這類反復炎癥也可導致全身骨量降低[22]，可能源于TNF、IL-6等細胞因子的激活，炎癥誘導骨吸收。二者可通過多種炎癥性疾病通路中靶點進行相互影響。HIF-1信號通路是VEGF表達的核心因子[23]，通過上調VEGF表達促進血管內皮細胞增殖，發揮VEGF在骨質疏松及NAFLD中的生理學效應。TNF、IBD、FoxO信號通路均是由炎癥反應誘導，涉及多種炎癥因子，調控骨質疏松及NAFLD進程。FoxO信號通路還可以調控氧化應激、葡萄糖和脂質代謝紊亂等過程[24]，這些炎癥及糖脂代謝過程均與骨質疏松、NAFLD息息相關。有研究[25]顯示, 當FoxO1鼠肝臟FoxO1過度表達會累積游離脂肪酸，促進肝臟細胞脂肪變性。雖然目前尚缺少研究探尋通路同時對兩種疾病的影響，但不可否認上述通路從各個方面協同作用，產生不同生理過程來協調骨質疏松與NAFLD關系。

本研究通過對多個數據庫進行基因信息整合，發現了兩組疾病復雜而龐大基因網絡中的交集部分，并發現了糖脂代謝及炎癥反應在兩種疾病間扮演的重要角色，考慮與脂肪毒性有關，但需進一步試驗驗證。