氣相色譜-氫火焰離子化法測定茶葉中5種可溶性糖的含量

◎ 蘇美丞，李 俊，蔡 滔，王 震，祝 愿，賴 飛，王藝蓉，王 志

（貴州省農產品質量安全監督檢驗測試中心，農業部農產品質量安全風險評估實驗室，貴州 貴陽 550004）

茶葉中的糖類物質含量占干物質的20%～25%，除構成細胞壁的纖維素、木質素、果膠質外，還有部分游離糖、結合態糖脂、蛋白糖等多糖，是茶葉中三大自然物質之一。茶葉中可溶性糖類中主要單糖是阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、半乳糖及甘露糖等，含量為0.1%～1.0%，雙糖有蔗糖、麥芽糖，三糖有棉子糖[1-2]。茶葉中可溶性糖是茶葉甜味成分之一，成品茶中可溶性總糖的含量因地區、品種、茶類不同的制茶技術而異，采摘鮮葉的老嫩度不同，含糖量也不同[3-5]。例如，六大茶類中，烏龍茶的可溶性糖含量最高。茶葉中糖類的存在與轉化對成品茶的香氣、滋味、湯色等都有直接的影響，加工過程中糖類的分解縮合反應不斷進行，糖含量為動態變化，而且不同的加工工藝內在的化學反應不同，糖的變化也不同[6-8]。因此，檢測茶葉中可溶性糖成分至關重要。

目前，可溶性糖的檢測方法主要包括比色法、紅外檢測法、高效液相色譜法、氣相色譜質譜聯用法和毛細管電泳法[9-15]。薄層色譜法和酶法適用范圍不廣，而高效液相色譜結合蒸發光散射檢測器（Evaporative Light Scattering Detector，ELSD）或示差折光檢測器（Refractive Ⅰndex Detector，RⅠD）在可溶性糖檢測中應用較廣[16-19]；但在分離多種糖組分方面仍存有一定的局限性，容易受到多組分分離度的影響[20-23]。當前方法僅側重于少數單糖的定量分析，茶葉中多種可溶性糖的同時檢測缺少統一的提取和分析方法。鑒于茶葉可溶性糖在茶葉品質和茶樹生長發育過程中的重要性，建立茶葉中多種可溶性糖同時檢測方法，有利于進一步推進茶葉品質研究工作。

氣相色譜法由于色譜分離效果較好，且氫火焰離子化檢測器較為穩定和普遍，是同時檢測茶葉多種可溶性糖的有效手段之一，可克服當前方法分離度不夠、物質成分單一、方法穩定性差等系列問題[24-28]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉樣品采購于市場，選擇不少于200 g茶葉經粉碎機粉碎，過60目篩，制成茶葉粉末樣品。

5種可溶性糖標準品：果糖（CAS號：7660-25-5）、葡萄糖（CAS號：50-99-7）、山梨糖醇（CAS號：50-70-4）、肌糖（CAS號：87-89-8）、蔗糖（CAS號：57-50-1），含量均≥99.0%。乙腈（CAS號：75-05-8，色譜純，美國天地）；吡啶（CAS號：110-86-1，分析純，國藥集團，需經過重蒸后使用）；N,O-雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺（CAS號：25561-30-2，含量≥99.0%，國藥集團）；甲氧胺鹽酸鹽（CAS號：593-56-6，含量≥98.5%，國藥集團）；苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（CAS號：1464-44-4，含量≥99.0%，國藥集團）。

1.2 儀器與設備

7890B氣相色譜儀，安捷倫，配有氫火焰離子化檢測器；AL-104分析天平，梅特勒-托利多。

1.3 樣品前處理方法

提取：稱量0.200 0 g茶葉粉末樣品于10 mL玻璃離心管中，加入苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷內標溶液和10 mL的1∶1（V∶V）的乙腈水溶液，振蕩提取30 min，4 000 r·min-1下離心10 min，取0.5 mL上清液轉移到新的1.5 mL離心管中，用氮氣吹干，待衍生。

衍生化：氮氣吹干后的樣液中加入350 μL甲氧胺鹽酸鹽溶液，80 ℃水浴30 min，放置室溫冷卻，然后再加入150 μL的N,O-雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺，80 ℃水浴60 min，室溫靜置1 h，再次離心后取上清液經氣相色譜分析。

1.4 儀器條件

色譜柱：（5%苯基）-甲基聚硅氧烷（HP-5）石英毛細管柱（60 m×250 μm，0.25 μm）；進樣口溫度：280 ℃；檢測器溫度：280 ℃；色譜柱程序升溫：80 ℃保持2 min，然后以5 ℃·min-1程序升溫至240 ℃，保持5 min，再以10 ℃·min-1的速度上升至300 ℃，保持15 min；載氣：氮氣，純度≥99.999%，流速：20 mL·min-1；燃氣：氫氣，純度≥99.999%，流速：40 mL·min-1；助燃氣：空氣，純度≥99.999%，流速：400 mL·min-1；進樣量：1.0 μL；分流比：20∶ 1，3.0 min后打開分流閥和隔墊吹掃閥。

1.5 標準溶液配制

標準儲備溶液配制：分別準確稱取5種水溶性標準物質（精確至0.000 2 g），用乙腈水溶液（1∶1，V∶V）配置成可溶性糖標準儲備溶液（果糖10 mg·mL-1；葡 萄 糖 20 mg·mL-1； 山 梨 糖 醇 4 mg·mL-1； 肌 糖4 mg·mL-1；蔗糖 40 mg·mL-1），0 ～ 4 ℃避光保存。

混合標準溶液配制：準確吸取一定量的5種可溶性糖標準儲備溶液于同一25 mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，配制成5個不同濃度的混合標準溶液（果糖 5 ～ 1 000 mg·L-1； 葡 萄 糖 10 ～ 2 000 mg·L-1； 山梨糖醇 2 ～ 400 mg·L-1；肌糖 2 ～ 400 mg·L-1；蔗糖20 ～ 4 000 mg·L-1），0 ～ 4 ℃避光保存。

內標溶液：選擇苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作為內標，準確量取苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（精確至0.000 2 g），乙腈水溶液（1∶1，V∶V）配置成10 mg·mL-1的內標溶液，0～4 ℃避保存光。

標準曲線配制：分別吸取0.5 mL 5個濃度的可溶性糖混合標準溶液于1.5 mL離心管中，各加入苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷內標溶液混勻。按1.3進行衍生化處理后經氣相色譜分析。

2 結果與分析

2.1 樣品提取方法比較

通過可溶性糖添加回收率考察2種樣品中目標物的提取方式（超聲與振蕩）在不同提取時間下的提取效率。具體步驟為稱取0.200 0 g茶葉粉末樣品加入一定量的可溶性糖標準溶液，加入苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷內標溶液和10 mL的的乙腈水溶液（1∶1，V∶V），分別用超聲和振蕩提取10 min、20 min、30 min，4 000 r·min-1下離心10 min，取0.5 mL上清液轉移到新的1.5 mL離心管中，用氮氣吹干，衍生后經氣相色譜分析，每組進行3次平行實驗。

結果表明，隨時間增加，目標物提取效果越好，其中30 min的提取時間對目標物的提取效果最好，回收率在75%～120%。超聲和振蕩的提取效果幾乎無差別，但由于超聲提取重現性較差，且綜合超聲提取具有噪聲大的弱點，選擇振蕩提取作為本方法的提取方式。

2.2 凈化條件的確定

在提取條件確定后，本實驗嘗試利用C18固相萃取柱凈化提取液，以減少樣品中雜質對目標峰的干擾，進一步提高色譜柱的柱效。通過比較未凈化與C18固相萃取小柱凈化后的色譜圖信噪比及雜質干擾情況，結果表明2種方法試驗后的目標物峰都沒有被干擾，相應的信噪比差異不大，表明C18固相萃取小柱的凈化效果并不明顯。故不考慮凈化，這樣能夠節省分析時間、簡化分析步驟、提高分析效率和節省實驗經費。

2.3 儀器條件選擇

氫火焰離子化檢測器具有高靈敏度且能夠檢測出大部分含碳有機物，相較于質譜檢測器，氫火焰離子化檢測器更為穩定和普及，且線性范圍大，可克服當前方法分離度不夠、物質成分單一、方法穩定性差等問題。因此，采用氫火焰離子化（Lame Ⅰonization Detector，FⅠD）檢測器作為本實驗的檢測器。

為分離目標物和干擾雜質，保證分析的靈敏度，通過調整程序升溫條件，將出鋒時間控制在60 min內，盡量使干擾分離；采用（5%苯基）-甲基聚硅氧烷（HP-5）石英毛細管柱（60 m×250 μm，0.25 μm）對5種可溶性糖進行分離，獲得的樣品色譜圖見圖1。

2.4 標準曲線線性范圍

采用內標法定量，以標準物質峰面積與內標物峰面積的比值為縱坐標（Y），以標準物質的量與內標量的比值為橫坐標（X）構建標準曲線，得到回歸方程及相關系數（R2），標準曲線、回歸方程和相關系數（R2）見表1。從表1可知，5種可溶性糖的標準曲線線性較好，相關系數R2均大于0.999。

表1 茶葉中5種可溶性糖工作曲線表

2.5 回收率、精密度及檢測限

在樣品中添加一定量的可溶性糖，按照上述前處理進行提取和衍生化后上機檢測。檢測限按照儀器噪音的3倍與標準曲線回歸方程中的斜率的比值確定。

5種可溶性糖在茶葉中的回收率在81.74%～100.55%，相對標準偏差在2.04%～9.49%，檢測限在9.5～12.2 ng·mL-1，說明本方法回收率高、精密度好，方法可靠；能夠準確檢測出茶葉中5種可溶性糖的含量。具體回收率、相對標準偏差和檢測限見表2。

表2 方法檢出限、精密度和回收率表（n=5）

2.6 實際樣品檢測

采用本方法對4種不同類型的茶葉（抹茶、紅茶、白茶、綠茶）進行檢測分析，結果見表3。實際樣品檢測中，5種可溶性糖均有檢出。果糖、葡萄糖在抹茶中含量最高，紅茶和白茶次之，綠茶中最低；山梨糖醇和肌糖在抹茶、紅茶和白茶中的含量明顯高于綠茶；蔗糖在抹茶和綠茶中的含量明顯高于紅茶和綠茶。

表3 不同類型茶葉可溶性糖含量表

3 結論

本文通過實驗建立了一種基于氣相色譜-氫火焰離子化法測定茶葉中5種可溶性糖的檢測方法，方法回收率較高，精密度較好，能夠實現茶葉中5種可溶性糖的同步檢測。