酸漿與毛酸漿的染色體研究

◎ 高習嘉，許 天，唐鑫雨，霍黎黎，李國泰，薛長松

（1.通化師范學院吉林省長白山生物種質資源評價及應用重點實驗室，吉林 通化 134000；2.吉林基蛋生物科技有限公司，吉林 長春 130000；3.通化果真不凡科技開發有限公司，吉林 通化 134000）

酸漿（Physalis alkekengiL.）與毛酸漿（Physalis pubescens Lamarck）均屬茄科[1]。二者營養價值高，味道甜美、清香可口，果實內含有多種維生素、礦物質、氨基酸和藥用成分，適合大眾消費，是老少皆宜的可食用特色漿果[2-3]。目前對于二者的研究主要集中在化學成分研究、栽培技術、功能性應用等方面[4]。本實驗優化酸漿與毛酸漿染色體制片方法，對多個不同地區種源進行體細胞染色體分析，擬從細胞水平上為酸漿、毛酸漿的新品種選育提供基礎研究參考依據，為酸漿、毛酸漿的功效評價篩選提供實驗材料[5]。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所選材料為多個地區酸漿屬市售或野外酸漿（紅菇蔦）與毛酸漿（黃菇蔦）種子，分別來源于吉林省、黑龍江省各地的種子市場或野外逸出種的采收。選取籽粒飽滿，大小均一的種子各若干份，每份20粒左右。

1.2 試驗步驟

首先將種子置于60 ℃溫水中進行燙種，待到水溫下降到室溫，取出，洗凈種子上的雜物。將被清洗過的種子放入事先配制好的0.1 mg·L-1赤霉素中，浸泡48 h，將其種皮軟化。軟化后將酸漿、毛酸漿種子取出，用濕潤的紗布將其包好，然后置于上下各墊有兩層濾紙的培養皿中，放入30～35 ℃恒溫箱，每過5 h換一次紗布，直至全部種子發芽，注意保持培養皿內濕潤，待根尖長至1 cm左右，取出，挑選其中品相完好，種牙沒有折斷的種子，備用。

1.2.1 預處理

在10:00或者15:00左右將備用的種子取出，小心剪取種子的根尖部位，把剪好的根尖放入對二氯苯飽和溶液進行預處理，預處理時間為5～6 h。

1.2.2 固定

將預處理后的種子根尖放入無水乙醇∶冰醋酸=3∶1中固定10 h左右，注意讓根尖保持在液面之下，不能讓根尖干燥。固定后將根尖取出，將殘留在表面的試劑用濾紙輕輕擦凈，然后將種子放入放置有60%乙醇溶液的培養皿中，4 ℃低溫保存，備用。

1.2.3 解離

將固定好的根尖取出，擦凈，放入裝有1 mol·L-1的鹽酸溶液的錐形瓶中，在60 ℃水浴鍋解離，解離時間一般為6 min或7 min（以解離程度完全為度調整時間，解離時間最長可至12 min左右，最短為6 min左右），解離后取出，蒸餾水清洗，重復3次，每次5～10 min。

1.2.4 染色壓片

將清洗后的根尖取出，在載玻片上切取根尖前端1 mm分生區，放在另一片干凈的載玻片上，滴入改良石炭酸品紅染色液，輕輕蓋上蓋玻片染色，用一手拇指輕輕按壓固定蓋玻片，另一手拇指輕刮蓋玻片使細胞分散，用濾紙吸出多余染色液。設定3個染色時間分別為15 min、20 min、30 min，觀察染色情況，最后取染色度較好的時間段為染色標準時間并適時調整。

1.2.5 顯微鏡觀察

將載玻片放在顯微鏡載物臺上，將根尖部位放置在光圈正中央，先用40倍物鏡找到清晰中期分裂相，再用100倍油鏡觀察清晰完整染色體，并記錄染色體染色情況，染色體條數。

2 結果與分析

2.1 染色條件優選

酸漿（紅菇蔦）與毛酸漿（黃菇蔦）種子種皮較硬，在試驗時發現發芽率過低，影響實驗進度。因此先考察了酸漿、毛酸漿種子萌發處理條件與方法，獲得了較好的萌發率。

對二氯苯飽和溶液是應用廣泛的預處理試劑，處理細胞的機制是破壞紡錘絲的形成，使細胞周期停留在有絲分裂中期，得到良好的染色體制片，以便于進行染色體的計數和形態觀察[6]。用冰水混合物的處理作用效果同化學試劑相同，得到有絲分裂中期的染色體制片[7]。現在也有越來越多的學者將預處理試劑混合使用[8]。本實驗中，分別對上述情況進行考察，結果發現對于酸漿與毛酸漿，用對二氯苯飽和溶液4 ℃處理2個品種的根尖，作用效果明顯，染色體較為清晰，易于觀察染色體數目。

植物細胞具有細胞壁，不利于后期的染色和制片[9]。解離的作用機制是軟化細胞壁去除果膠[10]。對于不同的植物材料，解離液的選擇和解離時間均不相同。本實驗中采用的是酸解方式，選用的解離液是1 mol·L-1HCl。作用效果明顯，解離后的細胞背景清晰。由于材料不同，解離時間也會有所不同。經考察，本實驗最終確定采用的是60 ℃酸解3～6 min，其中多數6 min的染色體圖像效果較佳。

實驗過程中，由于諸多可變因素均可影響實驗最終染色效果，因此實驗設置3個染色時間以應對諸多可變因素對實驗最終染色效果的影響。每次實驗中，按1.2.4設定的3個染色時間，分別在15 min、20 min、30 min時間段采樣，觀察染色情況進行試驗，選取染色度最佳的時間段作為該次實驗染色時間標準。實驗結果發現，本操作方法可以應對試驗過程中的復雜情況，獲得高效快捷的染色結果。同次實驗過程中不同時間染色效果舉例見圖1（a）、圖1（b）和圖 1（c）。

2.2 染色體數目

如圖2（a）、圖2（b）所示，經過觀察可以看出不同地區來源的與毛酸漿（黃菇蔦）與酸漿（紅菇蔦）染色體均為24條，且均為二倍體，都屬小型染色體。這與許亮等[7]和沙成卓等[9]報道的毛酸漿的結果一致，而且還與酸漿屬的掛金燈的染色體數目保持一致，均是以近中部著絲粒染色體和中部著絲粒染色體為主，這與其進化過程相一致[11-12]。

3 結論

植物染色體的數目、形態等是最穩定的細胞學特征之一，不同種的染色體有不同的數目、核型及體積等特征，表明了此種在系統演化的位置以及和相近種的親緣關系[13-15]。本研究結果表明，毛酸漿與同屬酸漿的染色體數目相似、核型相似，可為探討種間親緣關系提供參考，同時為酸漿與毛酸漿雜交、多倍體育種、篩選優質種質資源以及具功能性的特色食品產業化開發奠定了前期實驗基礎。