食品中羅丹明B快速檢測方法的研究

◎ 郝 冉

（廣東達元綠洲食品安全科技股份有限公司，廣東 廣州 510000）

羅丹明B（Rhodamine B，RB）是一種堿性鮮桃紅色的熒光染料，屬于非食品原料。因其價格低廉、色澤紅艷、性質穩定，不法分子將其作為調味品的染色劑，使調味品顏色鮮艷、賣相好，消費者長期食用易誘發癌癥[1-3]。我國將其列入《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑名單》中，明確規定其不允許用作食品添加劑及食品染色劑[4]。

本方法利用固相萃取和免疫層析技術原理來定性檢測辣椒粉、辣椒醬、番茄醬等調味品中羅丹明B的非法添加，具有操作簡單、靈敏度高、可通過肉眼直接判讀結果的特點，適用于各類企業、檢測機構、監督機構的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

采集市場64份樣品，包括辣椒粉、辣椒醬、辣椒油和番茄醬類樣品。

1.2 儀器與試劑

樣品濃縮儀（DCY08-1，常州康華儀器制造廠）。硫酸鎂、石油醚、丙酮和氨水（分析純，廣州化學試劑廠）；Cleanert COOH填料（天津博納艾杰爾科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 標準方法

參考《進出口食品中羅丹明B的檢測方法》（SN/T 2430—2010）對辣椒粉、辣椒油、番茄醬等樣品中羅丹明B含量情況進行測定[5]。方法開發技術指標參照《食品中羅丹明B的快速檢測 膠體金免疫層析法》（KJ 201703）[6]。

1.3.2 試劑及材料準備

提取劑：石油醚與丙酮以9∶1比例混合；層析小柱：以PP為篩板，稱取0.05～0.10 g Cleanert COOH裝于5 mL層析柱中；洗脫液：乙醇與氨水以100∶1混合；復溶液：0.02 mol·L-1磷酸鹽緩沖液，pH=7.2。

羅丹明B免疫層析檢測卡：利用戊二醛法將RB的衍生物羅丹明123（R123）與牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）、卵清白蛋白（Ovalbumin，OVA）分別合成完全抗原（R123-BSA）和包被抗原（R123-OVA），對6～8周齡雌性BALB/c小鼠皮下注射R123-BSA獲得多克隆抗體，膠體金作為示蹤標記物標記到硝酸纖維素膜（NC膜）上，涂覆R123-OVA作為檢測線，用羊抗鼠ⅠgG作為質控線，并組裝成膠體金檢測卡。

1.3.3 樣品前處理

稱取2.0 g樣品加入15 mL離心管中，加入3 g硫酸鎂，向離心管中準確加入8 mL羅丹明B提取液，大力振搖2 min（或混勻后超聲5 min），靜置直至分層或上清清澈（如樣品渾濁，可4 000 r·min-1離心2 min）。取2.5 mL上層清液過羅丹明B SPE小柱，洗耳球加壓，使液體以2滴/s的速度流下，充分擠干，棄去濾液。向小柱中加入2 mL羅丹明B乙醇，洗耳球加壓，使液體以2滴/s的速度流下，充分擠干，棄去濾液。將柱子置于10 mL離心管上方，向柱子中加入0.4 mL羅丹明B洗脫液，用洗耳球加壓，使液體以1滴/s的速度流下，充分擠干，收集洗脫液。將洗脫液于60～90 ℃樣品濃縮儀中吹干后，加400 μL羅丹明B復溶液，渦旋30 s，備用。

1.3.4 樣品檢測

取出羅丹明B免疫層析檢測卡，用移液槍移取100 μL待測液于微孔中，反復吹打3～5次，混合均勻，靜置3 min，把混合液全部轉移至加樣孔中，加樣后開始計時，5～8 min即可觀察結果，8 min后判讀無效。結果判定方法見圖1，若T線顯色（檢測線）比C線（質控線）深或一樣深，表示樣品中羅丹明B濃度低于檢測限或不含羅丹明B。若T線顯色比C線淺，或T線無顯色，表示樣品中羅丹明B殘留濃度高于檢測限。

2 結果與分析

2.1 方法檢測時間

選取6名人員，分別檢測1個樣品和6個樣品，并記錄檢測用時。由表1統計分析，不同人員檢測單個樣品用時在30 min以內，檢測6個樣品用時在60 min以內。

表1 不同人員檢測樣品用時試驗結果表

2.2 最低檢出限檢測結果

采用已知陰性的辣椒粉、辣椒醬、辣椒油和番茄醬樣品分 別 加標 0 μg·kg-1、2.5 μg·kg-1、5 μg·kg-1和10 μg·kg-1羅丹明 B，每個濃度點做 10 組，未加標與加標2.5 μg·kg-1羅丹明B樣品均判定為陰性，加標 5 μg·kg-1和 10 μg·kg-1羅丹明 B 組均為陽性。SN/T 2430—2010與KJ 201703兩種方法中羅丹明B的檢出限均為5 μg·kg-1，因此判定快檢方法適用于辣椒粉、辣椒醬、辣椒油和番茄醬的測定，對羅丹明B最低檢出限可判為5 μg·kg-1，檢測結果具有良好的重復性。考慮膠體金免疫層析技術存在的不確定范圍，未進一步做細化加標檢測。

2.3 樣品檢測結果

對市場上隨機抽檢64份樣品進行檢測，并與《進出口食品中羅丹明B的檢測方法》（SN/T 2430—2010）測定結果進行比較。由表2可見，兩種方法檢測63份樣品都為陰性，1份樣品都為陽性，兩者的符合率為100%。本方法通過大量的實驗室加標驗證，測試結果符合率為100%，由于樣品資源有限，未進行太多的實際陽性樣品驗證，不排除有假陰或假陽的可能性。

表2 樣品檢測結果表

2.4 抗干擾性能檢測

分別對已知陰性的辣椒粉、辣椒醬、辣椒油和番茄醬加標500 μg·L-1的蘇丹紅、日落黃、胭脂紅、莧菜紅、檸檬黃和糖精鈉，應用本快檢方法檢測，結果均呈陰性。

3 結論

傳統的檢測方法靈敏度高、特異性強，但存在樣品前處理較為復雜、耗時長和需要專業人員進行操作等缺陷，難以用于羅丹明B的現場快速檢測。本研究開發的羅丹明B快速檢測方法操作簡便、快速，樣品只需進行簡單處理，檢測單個樣品約30 min，6個樣品60 min以內即可出結果，不易受樣品成分的干擾，適用于辣椒粉、辣椒醬、辣椒油和番茄醬中羅丹明B的快速檢測。檢測樣品時，本方法測試靈敏度和測試結果與《進出口食品中羅丹明B的檢測方法》（SN/T 2430—2010）相吻合，且檢測限、靈敏度、特異性、假陰性率和假陽性率滿足《食品中羅丹明B的快速檢測 膠體金免疫層析法》（KJ 201703）技術要求。因此，該產品適合于各類企業、檢測機構、監督機構的快速檢測。