高效液相色譜法測定小麥粉中間苯二酚含量的不確定度評定

◎ 金 夢，王 嵐，宋 陽，官詠儀，張美金，鐘 鈺

（廣州海關技術中心，廣東 廣州 510623）

間苯二酚（Resorcinol）有防腐殺菌的作用，可用作防腐劑，添加于化妝品和皮膚病藥物糊劑及軟膏中。間苯二酚對人體具有中等毒性，可引起腎臟損傷或其他中毒癥狀。因為間苯二酚的防腐作用，被用于小麥粉中作為改良劑。2017年底，原國家食品藥品監督管理總局發布關于進一步加強小麥粉質量安全監管的公告，要求加強小麥粉質量安全監管，嚴查小麥粉濫用食品添加劑的行為，其中包括小麥粉中禁止使用間苯二酚[1]。

本文采用《小麥粉中間苯二酚的測定 高效液相色譜法》（BJS 202009）[2]中小麥粉的檢測方法進行實驗，依據《化學分析中不確定度的評估指南》（CNAS—GL006：2019）[3]和《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[4]，對測量結果進行不確定度評定，包括建立數學模型，量化已識別來源的不確定度分量，確定方法的合成標準不確定度和擴展不確定度，為小麥粉中間苯二酚檢測的質量控制提供科學依據。正確地評定小麥粉中間苯二酚，以保證測試結果的質量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-20AD高效液相色譜儀（配熒光檢測器，日本島津公司）；D-78224 Singen超聲清洗儀（德國ELMA）；3-18K高速離心機(德國SⅠGMA)。

間苯二酚標準品（純度≥99%，Dr.Ehrenstorfer）；甲醇（色譜純，廣州同源化工科技有限公司）；亞鐵氰化鉀（分析純，廣州化學試劑廠）；乙酸鋅(分析純，廣州化學試劑廠)；市售小麥粉。

1.2 標準溶液的配制

配制間苯二酚質量濃度為1.00 mg·mL-1的標準儲備液和質量濃度為10.0 mg·L-1的標準中間液。配制質量濃度分別為 0.010 0 mg·L-1、0.020 0 mg·L-1、0.100 mg·L-1、0.200 mg·L-1和 0.500 mg·L-1系列標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

稱取5 g（精確到0.001 g）試樣于25 mL容量瓶中，加入15 mL甲醇旋渦混勻，超聲15 min，放置至室溫后加入1 mL亞鐵氰化鉀溶液和1 mL乙酸鋅溶液，用甲醇定容至刻度，混勻1 min。于7 000 r·min-1離心3 min，取適量上清液過0.22 μm有機相濾膜后供液相色譜測定。

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，0.5 μm）；流動相：甲醇-水（梯度洗脫）；流速：1 mL·min-1；進樣量：20 μL；激發波長273 nm，發射波長304 nm。

1.5 建立數學模型

式中：X為試樣中間苯二酚的含量，mg·kg-1；c為由標準工作曲線得出的試樣中間苯二酚質量濃度，mg·L-1；V為試樣提取液定容體積，mL；m為試樣稱樣量，g。

考慮到樣品的均勻性、前處理的損失和污染、儀器變動等因素影響結果的重復性f，應在公式中加入重復性修正因子，則公式轉化為以下數學模型：

2 結果與分析

2.1 不確定度主要來源

根據《測量不確定度評定與表示》（JJF1059.1—2012）[4]評估小麥粉中間苯二酚的不確定度。其主要來源于間苯二酚標準溶液濃度（包括稱重天平的校準和重復性影響，定容器具校準和重復性的影響）、標準工作曲線的擬合不確定度、試樣稱重m（包括校準、重復性的影響）、試樣定容（包括溫度、量具校準和重復性影響）和試樣的含量測試重復性（樣品的均勻性、樣品前處理和儀器變動影響）等幾個方面，不確定度分量的因果關系見圖1[5-7]。

2.2 量化已識別的不確定度分量

2.2.1 間苯二酚標液的相對不確定度urel(Std)

（1）間苯二酚標準品純度的相對不確定度urel(P)。標準證書給出間苯二酚標準品的純度為99.83%，按矩形分布考慮，a=0.085%，包含因子屬B類評定，標準不確定度則標準品純度的相對不確定度

（2）間苯二酚標準品天平稱重的相對不確定度urel(m標)。通過稱重天平檢定證書給出最大稱量的示值誤差測量結果U=0.02 mg（k=2），按正態分布采用B類評定，標準不確定度為線性不確定度分量應重復計算2次，一次皮重，一次總重，產生的天平校準引入的不確定度為標 準 品 稱 量0.010 00 g，則標準品稱重時引入的相對標準不確定度為稱量使用的電子天平期間核查記錄，重復性標準偏差為6.31×10-6g，天平稱重的重復性引入因此間苯二酚標準品稱重時引入urel(m標)=

（3）由配制間苯二酚標準溶液使用的玻璃量具引入的相對不確定度urel(V)。配制標準溶液過程中使用了10 mL容量瓶（單標線）、1 mL流出式分度吸量管和100 mL容量瓶（單標線）[8]。依據《常用玻璃量器檢定規程》（JJG 196—2006）[9]，A類10 mL容量瓶允差為±0.02 mL，按三角形分布采用B類評定，包含因子則標準不確定度為8.17×10-3，則量具校準引入的相對標準不確定度為量具重復性引入不確定度屬A類評定，通過對典型的10 mL容量瓶充滿10次并稱量統計得出標準偏差為0.001 23 mL，充滿液體至容量瓶刻度的重復性引入的相對標準不 確 定 度 為則10 mL容量瓶對相對標準不確定度為urel(dil1)=

同理計算A類1 mL流出式分度吸量管允差為±0.008 mL，重復性標準偏差0.003 01 mL，則1 mL分度吸量管相對標準不確定度urel(dil2)=4.44×10-3；A類100 mL單標線容量瓶允差為±0.10 mL，重復性標準偏差0.019 7 mL，則100 mL容量瓶相對標準不確定度urel(dil3)=4.56×10-4。則配制標準溶液使用的玻璃量具引入相對不確定度為：

綜合（1）、（2）及（3）中的不確定度分量，可以得到配制間苯二酚標準溶液的不確定度為：

2.2.2 最小二乘法擬合曲線校準得出樣液質量濃度的不確定度urel(c0)

測定間苯二酚標準液，其質量濃度分別為 0.0100 mg·L-1、0.0200 mg·L-1、0.100 mg·L-1、0.200 mg·L-1和 0.500 mg·L-1， 各 1 次， 得 到 質 量 濃度的峰面積響應值分別為 44 528 Au·s、71 785 Au·s、348 101 Au·s、697 693 Au·s和 1 669 251 Au·s。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行擬合得到線性回歸方程A=B1c+B0=3.323 81×106c+14 519.8。式中n為標準溶液的測量次數，本例為5。對樣品測試液進行測定，測定次數為p，本例為2，得到二次測定峰面積響應值結果為341 253 mV和339 381 mV，由直線方程求得平均質量濃度c0=0.098 0 mg·L-1，本例標準溶液的平均濃度cj為各標準溶液濃度，則c0的標準不確定度為：

則c0的相對標準不確定度：

2.2.3 小麥粉試樣稱重m的不確定度urel(m樣)

根據電子天平檢定證書給出最大稱量的示值誤差測量結果U=3 mg（k=2），標準不確定度為線性不確定度分量應重復計算2次，一次是皮重，一次是總重，則引入的不確定度為試樣稱重質量m為5.000 g，則試樣稱重m引入的相對標準不確定度為：

2.2.4 小麥粉試樣前處理定容的不確定度urel(dil4)

試樣前處理定容采用容量瓶（單標線25 mL），其不確定度包括校準、溫度和重復性3個分量，其中重復性引入分量可合并入樣品測定重復性中。定容的不確定度分量表見表1。本例提取溶液為甲醇，操作溫度為（20±5）℃，20℃下甲醇的體積膨脹（α甲醇=1.18×10-3·℃-1）遠比玻璃膨脹系數（α玻璃=2.5×10-5·℃-1）大，則溫度對定容體積影響為Vtemp=V甲醇-V定容=α甲醇×V×ΔT=1.18×10-3×25×5=0.148 mL，按矩形分布采用B類評定，包含因子則溫度變化引入的相對標準不確定度為：

表1 試樣前處理定容的不確定度分量表

因此，試樣前處理定容引入的不確定度為：

2.2.5 小麥粉試樣含量測定重復性試驗引入的相對不確定度

由于試樣均勻性、前處理損失和儀器影響等因素都會引入不確定度，可將這些考慮包含在重復性實驗內，通過加標回收試驗評估重復性試驗引入的不確定度。在同等條件下對試樣進行6次加標獨立實驗，測試含量分別為 0.500 mg·kg-1、0.492 mg·kg-1、0.512 mg·kg-1、0.502 mg·kg-1、0.509 mg·kg-1和0.504 mg·kg-1，平均值為 0.503 mg·kg-1。按 A 類評定計算。試樣標準偏差S=0.007 05，算術平均值標準不 確 定 度試 樣含量測定重復性實驗引入的相對標準不確定度

2.2.6 不確定度的合成及擴展不確定度的計算

小麥粉中間苯二酚含量測定不確定度的來源及測量值結果見表2，實驗所得小麥粉中間苯二酚的含量x為0.503 mg·kg-1，則測量結果的合成標準不確定度為：

表2 測量不確定度分量表

按95%置信概率，取包含因子k=2，測量結果擴展不確定度為U=2u(x)≈0.035 mg·kg-1，測量間苯二酚含量可表示為（0.503±0.035）mg·kg-1（k=2）。

3 結論

本試驗通過對高效液相色譜法測定小麥粉中間苯二酚的含量不確定度的評定方法建立數學模型，對整個測量過程不確定度來源進行量化分析，可以判斷出不確定度主要來源于標準工作曲線擬合和試樣含量測試的重復性試驗所產生的不確定度，其次為標準品溶液的配制產生的不確定度，其他因素影響相對較小。最終得出小麥粉中間苯二酚的含量為（0.503±0.035）mg·kg-1，擴展不確定度為 0.035 mg·kg-1（k=2）。為獲得較小的不確定度測定結果，應控制好關鍵環節，主要包括盡量選用質量好、校準合格的量具，分析人員熟練方法，規范標準溶液的配制，注意樣品的均勻性，對分析天平和液相色譜儀定期校準維護保養，增加標準曲線點的測量次數和試樣含量的測量次數，以減少標準曲線和試樣重復性的不確定度，保證試驗結果的準確性和可信度。