高效液相色譜法同時測定鹽酸二甲雙胍中5種雜質的含量

◎ 馬金麗

（云南云測質量檢驗有限公司，云南 昆明 650500）

現階段，全球范圍內的糖尿病患者數量逐漸增多，其中90%以上的患者為2型糖尿病，這給醫療衛生產業帶來了巨大負擔。糖尿病患者需要長期借助藥物控制血糖，從而降低相關并發癥發生風險，延緩疾病進展[1]。鹽酸二甲雙胍是2型糖尿病治療中常用的藥物，這一藥物的臨床應用比較廣泛，且降糖效果明顯。目前市場上流通的鹽酸二甲雙胍有腸溶膠囊、緩釋片和片劑等，因廠家較多、制劑種類差異較大，不同廠家生產的藥物在質量上存在差異，尤其是一些雜質的存在，可能會在不同程度上威脅到人體的健康[2]。原料藥是鹽酸二甲雙胍制劑研究的重要基石，為提升用藥的安全性，需要展開鹽酸二甲雙胍原料藥中的雜質分析。

對鹽酸二甲雙胍原料藥合成工藝、降解途徑進行分析，可知原料藥中包含6種雜質，其中最常見的有5種，其結構見表1。為研究方便，分別將其命名為甲、乙、丙、丁和戊。目前，藥典僅僅對第一種雜質的含量作出了限定，而對于其他雜質，并無明確限定。且雜質甲正電性不佳，于陽離子交換柱上通常難以保留，和溶劑倒峰分離的情況不佳[3]。若測量中流動相選取離子對比劑或純水相磷酸二氫銨水溶液，可能損傷色譜柱，且檢測成本較高[4]。為提升雜質檢測的安全性及便利性，需要探討一種新的檢測方法。

表1 5種雜質的結構式表

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸二甲雙胍對照品（批號為1169-100A1，其純度100.0%）；雜質甲的對照品（純度質量分數98.0%）；雜質乙的對照品（純度質量分數98.8%）；雜質丙的對照品（純度質量分數98.2%）；雜質丁的對照品（純度質量分數100.0%）；雜質戊的對照品（純度質量分數99.5%）；鹽酸二甲雙胍原料藥（純度質量分數99.4%）；磷酸二氫鉀、磷酸、色譜純的乙腈與實驗室自制重蒸水。

1.2 儀器和設備

Waterse2695系統的高效液相色譜儀，配套檢測器是Waterse2998二極管陣列檢測器（美國Waterse2695系統）；CPA225D電子分析天平（德國賽多利斯）；SK2510HP超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；UV-1801型紫外-可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；精密pH計（PHS-3C，上海雷磁儀電股份有限公司）；電子分析天平（Sartorius BT-25S）。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶液配制

（1）制作供試品。準確稱取0.5 g鹽酸二甲雙胍藥物，在100 mL容量瓶中稱定，用體積比為80∶20的乙腈-水溶液作稀釋液，定容到刻度線后搖勻，獲得供試品溶液。

（2）制作對照溶液。從供試品溶液中，準確量取0.1 mL，將之放在容量瓶中（容積為100 mL），以稀釋液乙腈-水稀釋到容量瓶的對應刻度，將之搖勻，獲得對照溶液。

（3）制作雜質對照品儲備液。稱取含有雜質甲、乙、丙、丁和戊的鹽酸二甲雙胍對照品，甲雜質含量為2 mg，其他雜質含量均為1 mg。將之放在容量瓶內（容積為10 mL），加入適量重蒸水，將其溶解，稀釋到相應刻度后搖勻，獲得含雜質的對照品溶液，其中1 mL鹽酸二甲雙胍甲雜質含量為200 μg，其他雜質含量為1 mL鹽酸二甲雙胍雜質含量為100 μg。對其逐漸稀釋，稀釋倍數為10倍、100倍、1 000倍。

（4）制作系統適應性溶液。稱取50 mg鹽酸二甲雙胍對照品，放于容量瓶（10 mL），用體積比為80∶20的乙腈-水溶液作稀釋液將其溶解，精確量取0.05 mL含有雜質甲的對照品儲備液，分別量取0.25 mL含有其他4種雜質的對照品儲備液，將之放入上述容量瓶內，以稀釋液定容至刻度線，將之搖勻，作為系統適應性溶液。

（5）制作混合雜質對照品溶液。從含有雜質甲的對照品儲備液中，精密量取0.05 mL，從其他4種雜質對照品儲備液中，分別精密量取0.25 mL，放到同一個容量瓶內（10 mL），加入稀釋液至刻度線后停止并搖勻，獲得混合雜質對照品溶液。

1.3.2 色譜條件

所 用 色 譜 柱 為 Ultimate HⅠLⅠC Amphion Ⅱ，為 250 mm×4.6 mm，5 μm。 所 用 流 動 相 為 乙 腈-25 mmol·L-1磷酸二氫鉀，用磷酸對溶液的pH值進行調節，使其為3.50，所用體積比為80∶20。色譜柱的溫度為45 ℃，每次進樣量為20 μL。檢測時所用波長為213 nm，流動相的流速為1.0 mL·min-1。

2 結果與分析

2.1 系統適用性試驗

從前面制備的系統適應性溶液中取樣，根據1.3.2色譜條件進樣分析，對獲取的色譜圖做好記錄。如圖1所示，一級各雜質分離度均為2.0以上，而雜質甲保留時間（相對）是0.1。

2.2 精密度試驗

從系統適用性溶液中，準確量取20 μL，進行6次連續進樣。得到甲、乙、丙、丁和戊5種雜質的峰面積分別為0.64%、0.58%、0.52%、0.61%和2.1%，均在3.0%以內，說明這一檢測方法下，儀器具有良好的精密度。

2.3 檢測限分析

對各項雜質對照品儲備液進行逐級稀釋，從中精確量取20 μL，展開檢測，雜質定量限∶信噪比是10；雜質檢測限∶信噪比是3。分別制作雜質甲、乙、丙、丁和戊的定量限溶液，各制作6份。對各種溶液峰面積RSD進行計算。經過測量，雜質甲、乙、丙、丁和戊檢測限分別是 11.84 μg·L-1、29.36 μg·L-1、10.76 μg·L-1、10.57 μg·L-1和 180.26 μg·L-1； 定 量 限分 別 是 39.35 μg·L-1、98.79 μg·L-1、36.57 μg·L-1、35.41 μg·L-1和 605.78 μg·L-1；各項雜質 RSD 是 1.6%、1.0%、1.8%、1.5%和0.72%。

2.4 穩定性試驗

根據1.3.2中的色譜條件，量取鹽酸二甲雙胍混合雜質的對照品溶液，在室溫下分別在放置2 h、4 h、6 h、8 h、10 h和12 h時，從其中精確稱取20 μL溶液進行進樣檢測，對5種雜質的峰面積變化率（RE）和RSD進行測量。通過測量發現，在12 h內雜質對照品溶液中，各雜質峰面積變化率和RSD均為±3.0%范圍內（見表2），說明混合雜質對照品溶液，在這一時間段內是保持穩定的。

表2 穩定性試驗結果分析表

以相同方法對供試品的5種雜質進行檢測，發現5種雜質的RE和RSD均為±3.0%的范圍內，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.5 重復性試驗

根據系統適用性溶液配制方法，配制系統適用性溶液共6份，根據外標法，對各項雜質含量的RSD進行計算，結果依次為0.51%、0.72%、0.75%、0.48%和0.85%，均在3.0%以內，說明這一檢測方法具有優良的重復性。

2.6 回收率試驗

采集鹽酸二甲雙胍原料藥9份，精確稱取后，放在容量瓶之中（10 mL），將稀釋劑加入其中，超聲下溶解，將雜質甲的儲備液加入其中，加入量分別是0.04 mL、0.05 mL、0.06 mL，而其他4種雜質儲備液分別采集0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL。以稀釋劑將之稀釋到對應刻度之后搖勻，將之制作為不同濃度的回收率樣品溶液，共計9份。并根據外標法，對各種雜質不同濃度下平均回收率與RSD進行計算，具體結果見表3。各項雜質在不同濃度之下，回收率為92.9%～104.3%，RSD在3.0%以內，說明這一方法具有優良的準確度。

表3 回收率試驗結果表（單位：%）

2.7 鹽酸二甲雙胍中所含雜質測定結果分析

對4個廠家制造的鹽酸二甲雙胍原料藥中5種雜質的含量同時進行測定，先按照上述步驟，制作對照溶液，對檢測靈敏度進行調整，確保主成分色譜峰峰高為滿量程20%左右。精確量取20 μL系統適用性溶液、20 μL供試品溶液，按照1.3.2色譜條件，對樣品進行測定，采取外標法對各種已知雜質含量進行計算。雜質檢查的結果見表4。

對表4的測定結果進行分析，可知這4個廠家所生產的鹽酸二甲雙胍中，雜質甲含量在0.02%以內，而雜質乙、丙、丁和戊的含量，均比定量限小，總雜質含量低于0.2%。由此可見，4個廠家所生產的鹽酸二甲雙胍原料藥中，雜質的含量均符合相關要求。

表4 4個廠家鹽酸二甲雙胍中所含雜質測定結果表（單位：%）

3 結論

在鹽酸二甲雙胍原料藥物質分析中，各國的藥典均提倡以磺酸基陽離子交換柱進行檢測，而且只是對雜質甲展開含量限定[5-6]。但這一條件中，雜質甲出峰快，和溶劑峰的分離并不理想，因此筆者嘗試其他方法來進行研究。

為對鹽酸二甲雙胍中5種雜質同時進行檢測，可以通過陰陽離子交換色譜柱來實現。在選取流動相時，考慮到對色譜柱的損傷和檢測成本，筆者選取親水作用色譜，最終選擇Ultimate HⅠLⅠC AmphionⅡ色譜柱。另外，在檢測波長選擇時，5種雜質在210 nm附近均存在紫外吸收情況，雜質甲為主要雜質，其最大吸收波長為213 nm，因此本研究選取這一波長來進行檢測。

本文通過分析發現本研究的方法具有良好的系統適用性，各雜質和主藥能夠實現分離，而檢測中的重復性、精密性、穩定性試驗結果均理想。另外，在定量分析中，通過外標法來實施，其方法準確、簡單。總體來看，高效液相色譜法同時測定鹽酸二甲雙胍中的5種雜質的含量方法可靠、結果準確，可推薦應用。