胰激肽原酶緩解心肌缺血再灌注損傷大鼠氧化應激和纖維化

盧迎宏王 丹井海云王夢超李智慧

(鄭州大學附屬鄭州中心醫院心血管內科,鄭州 450007)

心肌缺血再灌注損傷是指心肌缺血一定時間后得到正常灌注,心肌組織損傷卻呈進行性加重的病理過程,嚴重時可導致猝死[1-2]。 研究表明,心肌缺血再灌注損傷是由心肌組織細胞中大量產生氧自由基、鈣離心超負荷及白細胞的炎癥作用等所引起的,具體的發病機制有待進一步研究[3]。 目前,臨床上治療心肌缺血再灌注損傷的方法主要有基因治療、缺血后適應治療和藥物靶向治療等[4-6]。藥物靶向治療在心肌缺血再灌注損傷中的應用已見成效,例如他汀類藥物、降糖藥、促紅細胞生成素等[7]。 胰激肽原酶(PKase)又稱胰激肽釋放酶,是哺乳動物胰腺等器官中提取的一種蛋白水解酶,具有血管舒張、改善血液循環和微循環、防止血栓形成等作用。 已有研究報道,胰激肽原酶在糖尿病腎病中發揮抗氧化應激、抗炎癥反應及抗組織纖維化等重要調控作用[8-9],但胰激肽原酶在心肌缺血再灌注損傷中的作用尚不知曉。 因此,本研究通過建立心肌缺血再灌注損傷大鼠模型,探究胰激肽原酶在大鼠心肌損傷、心肌氧化應激和纖維化中的作用,為心肌缺血再灌注損傷的臨床診斷與治療提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

50 只無特定病原體(SPF)級SD 大鼠,雄性,6～7 周齡,體重220～250 g。 由河南省實驗動物中心提供[SCXK(豫)2017-0001],本研究所有動物實驗操作完全遵守實驗動物倫理保護法及3R 原則,并經鄭州中心醫院相關動物實驗倫理委員會批準通過(ZXYY20200703)。 實驗動物飼養于鄭州大學實驗動物中心[SYXK(豫)2020-0008],動物飼養條件:每只大鼠給予12 h 光照/黑暗循環,自由獲取水和標準飲食,(20±2)℃和(60±5)%濕度環境下飼養。

1.2 主要試劑與儀器

胰激肽原酶(高純,50 U/mg)購自上海源葉生物科技有限公司(貨號S10219); HE 試劑盒(C0105S)購自碧云天生物科技有限公司;大鼠肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)(ml059533)、肌紅蛋白(Mb) (ml003054)、 心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cTn-Ⅰ)(ml003145)ELISA 試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司;SOD(A001-3-2)、MDA(A003-1-2)和GSH(A005-1-2)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所有限公司;Masson 染色試劑盒(G1340)、BCA 蛋白定量試劑盒(PC0020)、PT-PCR 試劑盒(RP1100)均購自北京索萊寶科技有限公司;Bax(ab32503)、Bcl-2(ab182858)、cas-9(ab184786)、cas-3(ab184786)、α-SMA (ab124964)、 TGF-β1 (ab215715) 和 FN(ab268020)兔單克隆抗體和HRP 標記的對應二抗均購自英國Abcam 公司。

心臟超聲診斷儀(Vivid7)購自美國GE 公司;ABI7500 Real-time PCR 系統(Applied Biosystems);酶標儀(RT6100)購自深圳雷杜生命科學股份有限公司;臺式高速離心機(D3024R)購自大龍興創實驗儀器(北京)股份公司;成像系統(Tanon-1600R)購自上海天能科技有限公司,光學顯微鏡(Nikon Eclipse E100)購自日本尼康公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物實驗

50 只大鼠隨機分為假手術組、模型組、模型加藥組共5 組(n=10)。 建模:模型組和模型加藥組大鼠采用左冠狀動脈前降支結扎法建立心肌缺血再灌注大鼠模型。 動物實驗前禁食12 h,腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,隨后將大鼠仰臥位固定于實驗板上,用4 根電極銀針支住大鼠四肢,用MS4000U-1C 型生物信號定量記錄分析系統檢測大鼠心電圖,氣管插管后用呼吸機輔助大鼠呼吸。在大鼠胸骨第3、4 肋骨間做開胸切口手術,暴露大鼠心臟,于冠狀動脈左前降支根部用帶線縫合針穿深度約1 mm,寬度1.8 mm 備用結扎,缺血30 min 后再灌注60 min 建立心肌缺血再灌注大鼠模型,以左室前壁紫紺及ST 段抬高,QRS 幅度升高即為手術成功,ST 段逐漸降低,左室前壁缺血區紫紺消失標志再灌注成功,假手術組只穿線不結扎。模型加藥組建模前參考文獻[10]分別腹腔注射1.5、3、6 U/kg 胰激肽原酶,持續給藥5 周(每天1次)。 記錄各組大鼠心率(HR)、左室收縮壓(LVSP)和短軸縮短率(FS),每組20 只。 術后12 h 收集各組大鼠尾靜脈血,然后實施安樂死,收集心臟組織用于后續實驗。

1.3.2 HE 染色觀察心肌病理損傷

取4%多聚甲醛固定的心肌組織,經石蠟包埋切片、脫蠟、水化后,行HE 染色;光鏡下拍照并觀察記錄組織形態學變化。

1.3.3 ELISA 檢測心損標記物含量水平

取100 μL 尾靜脈血,于3000 r/min、4℃離心15 min,取上清,按ELISA 試劑盒說明書測定各組大鼠血清中CK-MB、Mb、cTnI 含量。

1.3.4 試劑盒檢測氧化應激指標

經歷了建議1和建議2的教學后，學生可能對于數線的理解還存在難度。因為之前所接觸的線段模型（如圖10）和面積模型（如圖11），都是把整條線段或整個圖形看作整體“1”，小數表示的是線段中的一小段或圖形中的一小塊。

嚴格按照SOD、MDA 和GSH 檢測試劑盒測定各組大鼠血清中SOD、MDA 和GSH 含量。

1.3.5 Western blot 檢測線粒體損傷標記蛋白表達水平

從液氮中取出大鼠心肌組織,于室溫下解凍后用手術剪將組織剪切成小塊并置于勻漿研磨儀中研磨均勻。 用RIPA 蛋白裂解液于冰上提取總蛋白,用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白總濃度,每孔上樣20 μg,經SDS-PAGE 電泳分離、轉膜、脫脂奶粉封閉后,加入一抗(1 ∶1000),4℃搖床孵育過夜,第2 天回收一抗并加入HRP 標記的對應二抗(1 ∶5000),室溫孵育2 h。 用ECL 化學發光試劑于暗室下曝光顯影,將膠片掃描存檔整理去色后,分析并計算各組大鼠蛋白相對表達量,蛋白相對表達量為目標條帶和內參條帶(ACTIN)比值表示。 獨立重復實驗3 次取平均值。

1.3.6 Masson 染色觀察心肌組織纖維化程度

取4%多聚甲醛固定的心肌組織,按照Masson試劑盒說明書進行大鼠心肌組織Masson 染色。 藍色代表膠原纖維,紅色代表肌纖維。

1.3.7 RT-PCR 檢測α-SMA、TGF-β1 和FN mRNA表達水平

取液氮中保存的大鼠心肌組織約80 mg,溫室下解凍組織,超聲研磨均勻后在4℃、3000 r/min 條件下離心15 min,用TRIzol 試劑盒提取總RNA 并測定RNA 濃度和純度。 按逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA,按RT-PCR 試劑盒操作說明配制反應體系。 在PCR 擴增儀上進行擴增(擴增條件:保持步驟96℃15 s,40 個周期,95℃10 s 和60℃30 s),以目的基因和內參比值表示mRNA 表達水平,采用2-△△CT法分析結果。 重復實驗3 次,結果取平均值。 引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 統計學方法

使用SPSS 19.0 軟件分析,數據表示為平均數±標準差(ˉx±s)。 采用單因素方差進行組間比較,若方差齊則兩兩比較采用LSD 法,若方差不齊則兩兩比較采用Dunnett-t法。 以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胰激肽原酶對心肌缺血再灌注損傷大鼠HR、LVSP 和FS 的影響

注:a:假手術組;b:模型組;c:模型+1.5 U/kg PKase 組;d:模型+3 U/kg PKase 組;e:模型+6 U/kg PKase 組。 與假手術組相比,*P＜0.05;與模型組相比,#P＜0.05。

2.2 胰激肽原酶對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌病理損傷的影響

HE 染色觀察各組大鼠心肌組織病理損傷程度,如圖2 所示,假手術組大鼠心肌組織結構正常,排列規則,未見炎性細胞浸潤。 與假手術組比較,模型組大鼠心肌組織結構紊亂,心肌細胞腫大,可見大量肌纖維斷裂和炎性細胞浸潤。 與模型組比較,1.5 U/kg PKase 組仍然可見大量斷裂的心肌纖維和炎性細胞浸潤,3 U/kg PKase 組大鼠心肌細胞中可見少量炎性細胞浸潤,未見斷裂的心肌纖維和水腫變性的心肌細胞。 6 U/kg PKase 組大鼠心肌組織排列規則,僅見極少的炎性細胞浸潤,未見斷裂的心肌纖維和腫脹變性的心肌細胞。 結果提示,胰激肽原酶改善心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織病理損傷。

注:心肌纖維被染成淡紅色,細胞核呈藍紫色,黑色箭頭表示炎性浸潤細胞,綠色箭頭表示斷裂纖維。

2.3 胰激肽原酶對心肌缺血再灌注損傷大鼠心損標記物含量的影響

ELISA 檢測各組大鼠心損標記物CK-MB、Mb和cTnI 含量(見表2),與假手術組比較,模型組大鼠CK-MB、Mb 和cTnI 含量顯著升高(P＜0.05)。 與模型組比較,1.5 U/kg PKase 組大鼠CK-MB、Mb 和cTnI 含量無明顯變化(P＞0.05),3、6 U/kg PKase 組大鼠CK-MB、Mb 和cTnI 含量顯著降低(P＜0.05)。結果提示,胰激肽原酶能夠改善心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌功能。

表2 各組大鼠CK-MB、Mb 和cTnI 含量(ˉx±s,n=10)Table 2 Contents of CK-MB, Mb and cTnI in each group of rats

2.4 胰激肽原酶對心肌缺血再灌注損傷大鼠氧化應激水平的影響

與假手術組比較,模型組大鼠血清中SOD 和GSH 含量明顯降低,MDA 含量升高(P＜0.05)。 與模型組比較,1.5 U/kg PKase 組大鼠血清中SOD、MDA 和GSH 含量無明顯差異(P＞0.05),3、6 U/kg PKase 組大鼠血清中SOD 和GSH 含量升高,MDA含量降低,且差異具有統計學意義(P＜0.05),見圖3。 結果提示,胰激肽原酶能夠緩解心肌缺血再灌注損傷大鼠氧化應激水平。

注:a:假手術組;b:模型組;c:模型+1.5 U/kg PKase 組;d:模型+3 U/kg PKase 組;e:模型+6 U/kg PKase 組。 與假手術組相比,*P＜0.05;與模型組相比,#P＜0.05。

2.5 胰激肽原酶對心肌缺血再灌注損傷大鼠線粒體功能的影響

與假手術組比較,模型組大鼠心肌組織中Bax/Bcl-2、cleaved cas9/cas9 和cleaved cas3/cas3 蛋白水平顯著升高(P＜0.05)。 與模型組比較,1.5 U/kg PKase 組大鼠心肌組織中蛋白水平無明顯差異(P＞0.05),3、6 U/kg PKase 組大鼠心肌組織中Bax/Bcl-2、cleaved cas9/cas9 和cleaved cas3/cas3 蛋白水平顯著降低(P＜0.05),見圖4。 結果提示,胰激肽原酶能夠緩解心肌缺血再灌注損傷大鼠線粒體功能損傷。

注:A:Western blot 檢測線粒體損傷標記物蛋白表達;B:蛋白相對表達量。 與假手術組相比,*P＜0.05;與模型組相比,#P＜0.05。

2.6 胰激肽原酶對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌纖維和炎癥因子的影響

如圖5 所示,假手術組大鼠心肌細胞排列整齊,染色均勻,未見炎癥細胞浸潤且間質內無增生纖維。 與假手術組比較,模型組大鼠心肌細胞排列紊亂,間質內充滿大量、均勻的藍色纖維網,部分纖維斷裂,可見炎癥細胞浸潤。 與模型組大鼠比較,1.5 U/kg PKase 組大鼠仍可見大量炎癥細胞浸潤,間質內藍色纖維網稍有減輕。 3 U/kg PKase 組增生的藍色纖維網明顯減少,可見少量炎癥細胞浸潤,6 U/kg PKase 組大鼠間質內增生的藍色纖維網顯著減少或消失,僅可見極少的纖維條,心肌細胞中未見炎性細胞浸潤。 結果提示,胰激肽原酶能夠改善心肌缺血再灌注大鼠心肌纖維化。

注:心肌纖維被染成紅色,膠原纖維被染成藍色,黑色箭頭表示炎性浸潤,綠色箭頭表示膠原纖維。

2.7 胰激肽原酶對心肌缺血再灌注損傷大鼠纖維化標記蛋白水平的影響

與假手術組相比,模型組大鼠心肌組織中α-SMA、TGF-β1 和FN mRNA 和蛋白水平均顯著上調(P＜0.05)。 與模型組比較,1.5 U/kg PKase 組大鼠α-SMA、TGF-β1 和FN 在mRNA 和蛋白水平均無明顯差異(P＞0.05),3、6 U/kg PKase 組大鼠心肌組織中α-SMA、TGF-β1 和FN mRNA 和蛋白水平均顯著下調(P＜0.05),見圖6。 結果提示,胰激肽原酶能夠緩解心肌缺血再灌注大鼠心肌組織纖維化。

注:A:RT-PCR 檢測α-SMA、TGF-β1 和FN mRNA 水平;B:Western blot 檢測α-SMA、 TGF-β1 和FN 蛋白水平;C:蛋白相對表達量。 與假手術組相比,*P＜0.05;與模型組相比,#P＜0.05。

3 討論

心肌缺血再灌注發生前會產生大量的氧自由基,從而引起心肌纖維化和心肌損傷,心臟功能障礙等[11]。 因此,及時清除氧自由基和降低心肌纖維水平能夠有效緩解心肌損傷和心臟功能。 Xie 等[12]發現,心肌缺血再灌注大鼠血清CK-MB、Mb 和cTnI水平明顯升高,α-SMA、TGF-β1 和FN 含量極高,SOD 和GSH 含量降低,MDA 含量升高,經給藥治療后,心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷明顯好轉,氧化應激和炎癥水平降低,纖維化程度得到改善。 本研究結果發現,經胰激肽原酶給藥治療后,心肌缺血再灌注大鼠心臟功能明顯好轉,心肌病理損傷得到改善,心肌氧化應激、纖維化水平降低。 因此,胰激肽原酶通過降低心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌氧化應激和纖維化水平緩解大鼠心肌損傷。

本研究前期檢測了各組大鼠心臟功能、心肌病理損傷程度和心肌損傷標記物含量水平,結果顯示,模型組大鼠HR、LVSP、FS 明顯低下,心肌病理損傷嚴重,CK-MB、Mb 和cTnI 含量極高。 經胰激肽原酶給藥治療后,心肌缺血再灌注損傷模型大鼠心臟功能顯著得到改善,心肌病理損傷及損傷標記物含量減少。 結果提示,胰激肽原酶對心肌缺血再灌注大鼠心臟功能、心肌損傷具有調控作用。 為明確胰激肽原酶調控模型大鼠心肌功能的作用機制,本實驗還檢測了各組大鼠心肌組織中氧化應激和纖維化水平。

氧化應激發生積累的大量氧自由基促使心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞膜通透性增加,從而使得胞內的SOD 釋放到細胞外。 同時,MDA 含量增加誘發機體發生脂質過氧化反應,最終破壞機體正常的氧化與抗氧化平衡狀態,進一步加重心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷[13-17]。 本實驗顯示,在模型組大鼠心肌組織中SOD 和GSH 含量明顯降低,MDA 含量升高,經胰激肽原酶治療后,心肌缺血再灌注大鼠心肌組織中SOD 和GSH 含量顯著升高,MDA 含量降低。 由于線粒體功能與氧化應激密切相關,若氧化應激水平極高,則會導致線粒體膜通透性增加及氧自由基的大量產生,使得線粒體腫脹、功能受損、細胞內鈣離子超載,最終引起細胞死亡[18-20]。 因此,線粒體損傷程度能夠從側面反應機體氧化應激水平及正常組織功能。 本研究通過檢測各組大鼠線粒體損傷標記物蛋白表達水平,結果發現,經胰激肽原酶給藥治療后,心肌缺血再灌注大鼠心肌組織中Bax/Bcl-2、cas-9、cas-3 水平顯著降低,結合前期實驗結果可知,胰激肽原酶可能通過調控模型大鼠心肌氧化應激水平改善大鼠心臟和線粒體功能,緩解心肌病理損傷。

α-SMA 是血管平滑肌細胞中的一種細胞骨架蛋白,與心肌細胞纖維化的發生發展有關,是肌成纖維細胞的特異性標志物[21]。 TGF-β1 是新發現的調節細胞生長和分化的TGF-β 超家族,具有抑制心肌細胞分化的作用[22]。 FN 是是心肌細胞外基質的主要結構蛋白之一,在心肌細胞粘附性和運動能力中發揮著重要作用[23]。 本實驗結果顯示,經胰激肽原酶治療后,心肌缺血再灌注大鼠心肌組織中α-SMA、TGF-β1 和FN 表達水平顯著降低,結果提示,胰激肽原酶通過降低心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織纖維化水平緩解大鼠心肌損傷。

綜上所述,胰激肽原酶在心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌損傷、氧化應激和纖維化中具有調控作用。 本實驗從動物水平上初步說明胰激肽原酶在心肌缺血再灌注損傷中的調節作用,后續實驗我們計劃進一步探究胰激肽原酶的具體調節作用機制,為胰激肽原酶的臨床應用及藥物研發提供更加充分的理論依據。