西藏昌都地區96例兒童急性腹瀉病毒分子流行病學分析

毛俊文 楊婭麗 石長春 陳竹 李春 王永明2,,5 李琳彬 陳軍華,

（1.重慶醫科大學附屬兒童醫院感染科∕國家兒童健康與疾病臨床醫學研究中心∕兒童發育疾病研究教育部重點實驗室，重慶 400016；2.兒科學重慶市重點實驗室，重慶 400016；3.昌都市人民醫院兒科，西藏昌都 854000；4.重慶市中醫院檢驗科，重慶 400016；5.重慶醫科大學附屬兒童醫院新生兒科，重慶 400016）

我國是全球腹瀉病高負擔國家之一［1］，除了輪狀病毒外，諾如病毒、腺病毒、星狀病毒、札如病毒也是導致腹瀉的重要病原體。Yu等［2］關于5年兒童腹瀉病原學監測結果顯示，輪狀病毒占29.7%，諾如病毒占11.8%，腺病毒占4.8%，星狀病毒占3.2%，札如病毒占1.8%。

自2009年起，中國疾病預防控制中心聯合多家機構針對腸道病原體建立實驗室監測網絡，監測腸道病原體流行狀況，但缺少西藏地區的數據［3］。而西藏地區由于其氣壓低、缺氧、寒冷、紫外線強、干燥，并且居民種族、生活習慣、經濟與文化狀況等均有別于其他地區，故高原的相關病毒分子流行病學可能與其他地區有不同。本研究對西藏昌都地區急性腹瀉患兒的糞便標本進行輪狀病毒、諾如病毒等多種病毒分子流行病學特征分析，旨在了解本地區急性腹瀉患兒流行的病毒株的基因特征，為本地區兒童急性腹瀉病毒流行狀況監測及預防和控制提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2018年11月至2020年11月于西藏昌都市人民醫院就診的急性腹瀉患兒共99例，其中男57例，女42例，平均年齡32.3個月（1個月至14歲）。平均病程為6 d（范圍：1～14 d）。納入其中96例完成了完整的糞便標本病原學檢測的患兒作為研究對象（男56例，女40例），平均年齡38.2個月（1個月至14歲）。根據《腹瀉癥候群病原學監測與檢測技術》［4］進行急性腹瀉的診斷：（1）病程≤14 d；（2）每日大便次數≥3次或有性狀改變，如稀水樣便、蛋花樣便等。

1.2 樣本的采集和核酸提取

糞便標本均在患兒入院后48 h內，或門診當日采集，放置在-80℃冰箱備用。取約500μL大便標本加標本預處理液（PBS液）稀釋，震蕩混勻后取2～3滴使用A群輪狀病毒抗原檢測試劑盒（膠體金法，四川邁克生物科技有限公司）初篩檢測輪狀病毒，然后將稀釋液靜置10 min，8 000 r/min離心5 min，吸取上清液，嚴格按照臺灣旭基病毒核酸純化試劑盒進行病毒核酸提取。

1.3 RNA病毒逆轉錄及病毒初篩

按照反轉錄試劑盒RR037A將輪狀病毒（預篩選）、諾如病毒、星狀病毒、札如病毒RNA進行逆轉錄，按照全國病毒性腹瀉檢測方案的引物及實驗操作法進行PCR。輪狀病毒擴增VP7基因及VP4基因保守區，腺病毒擴增六鄰體Hexon區核酸序列，諾如病毒擴增NoV衣殼區部分，星狀病毒擴增ORF2區核酸序列，札如病毒擴增VP1區核酸序列。最后將擴增引物于瓊脂糖凝膠電泳，以100 bp DNA Marker作為參照，根據擴增條帶位置判斷結果。

1.4 樣本測序及生物信息學分析

將陽性擴增產物送至北京六合華大基因科技有限公司進行測序后，使用DNAstar編輯核酸序列，并行BLAST比對，使用MEGA-X（Clustal W）構建進化樹，使用鄰接法（neighbor-joining）選擇Kimura 2-prameter核苷酸替代模型，以bootstrap method 1 000為參數，構建系統進化樹進行分析。

1.5 統計學分析

使用Microsoft Office Excel 2019、SPSS 22.0處理和分析數據。計數資料采用頻數和百分率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同季節組及不同年齡組病毒檢出率的比較

腺病毒、諾如病毒、星狀病毒、札如病毒、輪狀病毒這5種病毒總陽性率為39%（37/96）。排除混合感染后，各季節5種病毒總陽性率分別為：春季（3～5月）31%，夏季（6～8月）7%，秋季（9～11月）51%，冬季（12月至次年2月）50%。不同季節間病毒檢出總陽性率差異有統計學意義（P=0.010），其中冬春秋季節陽性率較高，夏季較低，見表1。

腺病毒、諾如病毒、札如病毒、輪狀病毒在不同季節間的陽性率差異均無統計學意義（P＞0.05），而星狀病毒在不同季節間的陽性率差異有統計學意義（P=0.014），其中秋季陽性率最高（31%），見表1。

表1 病毒檢出的季節分布 ［例（%）］

不同年齡組患兒病毒檢出總陽性率差異有統計學意義（P=0.049），以2歲～組陽性率最高（65%），5～14歲組最低（19%）。而不同年齡組腺病毒、諾如病毒、星狀病毒、札如病毒、輪狀病毒這5種病毒的陽性率差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 病毒檢出的年齡分布 ［例（%）］

2.2 病原學檢測結果

在96例患兒中，檢測出腺病毒7例，陽性率為7%，其中F41型6例，C2型1例。檢測出諾如病毒9例（其中1例同時感染諾如病毒GⅠ型和GⅡ型），陽性率為10%，其中GⅠ7例，GⅡ3例。GⅠ中GⅠ.3 6例，GⅠ.7 1例；GⅡ中GⅡ.3 1例，GⅡ.4 Sydney_2012型2例。檢測出星狀病毒16例，陽性率為17%，均為HAstrV-1型。檢測出札如病毒5例，陽性率為5%，其中GⅠ.2 1例，GⅠ.6 1例，GⅡ.1 1例，2例未知分型。檢測出輪狀病毒8例，陽性率為8%，其中G基因分型：G9型6例，2例未分型；P基因分型：［P8］型7例，［P6］型1例；G基因型和P基因型組合僅1例，G9［P8］6例。見表3。

表3 96例患兒病原學檢測結果

2種病毒混合感染情況：腺病毒和星狀病毒混合感染3例，輪狀病毒與星狀病毒混合感染1例，輪狀病毒與札如病毒混合感染1例，腺病毒和諾如病毒混合感染1例，札如病毒和星狀病毒混合感染1例。3種病毒混合感染情況：腺病毒、諾如病毒和星狀病毒混合感染1例。無4種或5種病毒混合感染。

2.3 進化樹分析

腺病毒的進化樹如圖1：F41型6例，彼此同源性高（97%～99%），與北京株（MT150517.1）及參考株（MT362538.1）同源性在98%～100%之間；C2型1例，與美國株（KF268129.1）有高同源性。

諾如病毒的進化樹如圖2：GⅠ.3型6例，彼此同源性高，與參考株（MN922742.1、MZ021896.1）有較高的同源性（96%～98%）；GⅠ.7型1例，與參考株（NC044856.1）有較高的同源性（96%）；GⅡ.4 Sydney_2012型2例，與參考株（MH842243.1）同源性高（98%～99%）；GⅡ.3型1例，與參考株（MT501834.1）同源性高（98%）。

星狀病毒的進化樹如圖3：HAstrV-1型16例中，有15例彼此同源性高，與參考株（MG970076.1、MG970071.1）同源性在98%～100%之間。

札如病毒的進化樹如圖4：GⅠ.2 1例，與參考株（KU973904.1）同源性高（99%）；GⅠ.6 1例，與參考株（LC380411.1）同源性高（97%）；GⅡ.1 1例，與參考株（LC549586.1）同源性高（96%）；剩余2例分型不能確認，與其他株同源性較差。

輪狀病毒的進化樹如圖5～6：G9型6例，均與參考株（LC172445.1、MF580843.1、MW058212.1）有高同源性（98%～99%）；［P8］型7例，與參考株（KF648954.1、KF648953.1、MT939994.1）有高同源性（98%～99%）；［P6］型1例，與參考株（LC372870.1）有高同源性。

3 討論

感染性腹瀉通常是由病毒和細菌感染引起的，是一種發病率高、流行范圍廣的全球性傳染病，對人類，特別是對兒童的公共衛生構成嚴重挑戰。我國腹瀉的總體發病率為0.17～0.70/人年［5］。輪狀病毒和諾如病毒是最常見的導致急性腹瀉的病毒，但腺病毒、星狀病毒、札如病毒亦是重要的致瀉病毒［6］。

諾如病毒是一種無包膜、單股、正鏈的RNA病毒，基因組至少有7.5 kbp，編碼3個主要的開放閱讀框架（ORF1、2和3）［7］，分別主要編碼RNA聚合酶、衣殼蛋白VP1和小衣殼蛋白VP2。本組病例中諾如病毒檢出陽性率為9%，與既往全國27省監測的總陽性率（11.6%）相似［8］，但顯著高于其中同高原寒帶地區青海的陽性率（2.6%）［8］。本組病例病毒檢出陽性率低于杭州地區（23%）［9］，也低 于 湖 北（12.5%）［10］及 新 疆 烏 魯 木 齊（16.8%）［11］。有研究表明，氣溫、降雨、濕度等外環境可能影響諾如病毒的流行［12］，故不同氣候帶的諾如病毒的檢出率有差別，且流行高峰也存在差別［8］。本研究顯示諾如病毒主要在秋冬季節檢出，可能是干冷的氣候有利于諾如病毒活動［13］。但本研究未發現其明顯季節性及不同年齡層陽性率差異，可能與樣本量較小有關。由于ORF1/2邊界區域的亞型間基因組重組［14］，諾如病毒具有高變異性。目前全球60%～90%的諾如病毒感染都是由新出現的GⅡ.4型病毒引起［15］，但本研究以GⅠ.3為主要型別，不同于我國其他省市［8，11，16］。Mans等［7］關于1997～2018年中低收入國家諾如病毒流行病學調查結果顯示，GⅠ.3為GⅠ基因組中最常見基因型，但仍以GⅡ.4為最常見基因型。臺灣地區2015～2019年曾監測到GⅠ.3的流行［17］。這提示不同地區諾如病毒基因型的流行趨勢不同，但這仍需要持續的病原學監測支持。

腺病毒是無包膜雙鏈DNA病毒，已經被識別并分成7個種，即A～G［5］。40/41型（F種）是引起兒童腹瀉的常見型別，B、C亞屬腺病毒則常常導致呼吸道感染［18］。本研究未發現腺病毒明顯的季節流行，與烏魯木齊的研究結果相同［19］。本研究腺病毒陽性率為7%，高于同年北京地區（4.2%）［20］及呼和浩特（1.22%）［21］的陽性率。在孟加拉國、巴西、韓國、中國和日本等幾個國家進行的腺病毒流行病學研究表明，腺病毒在腹瀉病例中的流行率從2%到10%不等［22］。本研究未發現腺病毒檢出的年齡差異，與湖北省的研究結果［23］相同。腺病毒基因型主要為F41型，與上海［24］及其他中低收入國家的研究結果［18］相同。有研究指出，隨著輪狀病毒疫苗覆蓋率的不斷提高，腺病毒有可能成為兒童胃腸炎的主要原因［18］。

星狀病毒無包膜的單股正鏈RNA病毒，根據ORF2區核酸序列可分為1～8個基因型，目前HAstrV-1型在全世界范圍內廣泛流行［25］。本研究中星狀病毒陽性率為17%，遠高于2015年我國l7省 市 監 測 結 果（3.4%）［26］，也 遠 高 于 北 京（2.9%）［20］、內蒙古［21］（0.22%）、杭州（1.63%）［9］的陽性率。日本報道其陽性率達到16.4%［27］，泰國報道其陽性率僅2.6%［28］。有研究發現星狀病毒感染有明顯的季節性特征，溫帶以冬季為主要流行季節［29］，且星狀病毒感染率高的地區多位于我國西部及北部地區［26］。西藏昌都地區常年氣溫較低，與星狀病毒高感染率有關，且發現該地區星狀病毒檢出率有明顯的季節性，為秋冬季節流行。

札如病毒為無包膜的單股正鏈RNA病毒，基于VP1區核酸序列可分為多個基因群，感染人的主要是GⅠ、GⅡ、GⅣ、GⅤ基因群［30］。本研究札如病毒陽性率為5%，高于2012～2014年我國8個省市的札如病毒陽性率［31］，與杭州（4.22%）［9］的陽性率類似，高于湖北（0.98%）［23］的陽性率。本研究札如病毒為夏、秋、冬季節散在分布，未發現季節流行性，與烏魯木齊調查結果［19］類似，但陽性例數檢出較少，且型別更多樣。

輪狀病毒是一種無包膜雙鏈RNA病毒，屬于呼腸孤病毒科，根據病毒蛋白VP7和VP4，可分為G型和P型，不同的基因型組合的分布在地理和年代上都存在差異［32］。本研究的輪狀病毒陽性率為10%，低于其他地區，如湖北（12.58%）［33］、杭州（17.3%）［32］、山西（19.0%）［34］、蘇州（26.0%）［35］。韓國急性胃腸炎兒童中輪狀病毒檢出率僅9.7%［36］，而2019年莫斯科為20.67%［37］，印度甚至高達36.9%［38］。我國2011～2014年針對26省的輪狀病毒流行病學分析結果顯示，我國南部和中部檢出率最高，高原寒帶檢出率最低［3］。本研究中輪狀病毒檢出率未發現明顯季節性差別，不同于湖北［33］、吉林［39］等地的結果，但都在冬春季節檢出率高，夏季最低，有明顯的時間和空間流行特征［3］。有研究發現輪狀病毒檢出率與氣溫成負相關［35］。本研究顯示在3歲以內兒童檢出率為12.5%（8/64），5歲以上兒童中未檢出輪狀病毒，但發現各年齡組間檢出率差異無統計學意義，這不同于26省調查結果［3］，可能與本研究樣本量較少有關。本組病例輪狀病毒基因型主要為G9［P8］，與我國26省調查結果［3］相同。隨著時間的變化，以及疫苗的上市，G9P［8］、G2P［4］基因型逐漸替代G1P［8］、G3P［8］基因型成為流行株［32，40］。掌握地區病毒基因型的變化特點，有利于政府制訂更有力的干預措施。

本研究受限于西藏地區的樣本持續獲取，且僅收集了單中心2018～2020年樣本，故未來仍需西藏多中心的大樣本分析。本研究僅對諾如病毒部分衣殼區序列分析，未來對完整的VP1基因，特別是氨基酸序列分析是非常有必要的，有助于了解病毒抗原表位特征。

綜上，本研究對西藏昌都地區96例急性腹瀉患兒進行了病原學檢測，顯示星狀病毒以秋冬季節流行為主，腺病毒、諾如病毒、札如病毒、輪狀病毒無明顯流行季節，不同年齡組患兒上述5種病毒檢出率無明顯差異。星狀病毒陽性率最高（17%），諾如病毒次之（9%），札如病毒相對較低（5%）。通過構建進化樹分析，顯示腺病毒以F41型為優勢株，諾如病毒優勢株為GⅠ.3，星狀病毒優勢株為HAstrV-1，札如病毒散發GⅠ.2、GⅠ.6、GⅡ.1，輪狀病毒優勢株為G9［P8］。未來仍需多中心合作的持續病原學監測來完善西藏兒童腹瀉病毒流行趨勢，為疫苗研究及干預措施的制訂提供依據。