宏基因組二代測序在兒童重癥感染中的應用價值

鄭一惠 林威 張天蕾 房宇 陳濱溫 潘國權 林振浪

（溫州醫科大學附屬第二醫院∕育英兒童醫院 1.新生兒科；2.急診與重癥醫學科，浙江溫州 325000）

感染性疾病常見的病原體為細菌、病毒、真菌、支原體、衣原體等，它們通過多種途徑進入機體引發炎癥反應。兒童作為特殊群體，免疫系統發育不成熟，容易感染各種病原體，感染性疾病為兒童死亡的主要原因［1-2］。臨床上對重癥感染性疾病的病原學診斷通常依賴傳統病原體培養，但該法培養陽性率低，受限于入院前是否使用過抗生素且對病毒和結核分枝桿菌等特殊病原體培養困難。因此，急需一種高靈敏度、高特異度、快速的兒童感染性疾病病原體的檢測方法。

宏基因組二代測序（metagenomic nextgeneration sequencing，mNGS）是利用高通量測序技術及生物信息分析技術對樣品中的核酸進行測序分析，利用微生物專用數據庫進行比對分析，檢出致病微生物，輔助臨床診療決策［3］。mNGS已逐步應用于感染性疾病的診斷。目前mNGS報道多以成人為主，涉及兒童的不多［4-7］。已有的研究表明，伴發熱的血流感染患兒中mNGS的檢測陽性率顯著高于傳統血培養，可以作為兒童伴發熱的血流感染臨床診治的輔助手段［4］。在兒童重癥肺炎的診治中，因為mNGS極高的靈敏度，可提高臨床上病原學診斷率［5］。mNGS能克服傳統微生物標本檢出率低的困難，對尤其是結核、真菌、病毒及特殊病原體等的檢出具有診斷優勢［6-7］。所以臨床診療過程中使用mNGS可以提高診療水平，促進抗生素的規范化使用，提高重癥感染患兒的治愈率。本研究對我院兒童重癥監護室收治的29例重癥感染性疾病患兒的臨床資料進行回顧性分析，探討mNGS在病原體檢測及指導診療方面的臨床應用價值，并分析影響其檢出率的因素，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取我院2018年6月至2020年12月兒童重癥監護室收治的重癥感染性疾病患兒29例。患兒均符合重癥感染診斷標準：（1）膿毒癥相關器官衰竭 評分（Sepsis-Related Organ Failure Assessment）較基線上升≥2分；或（2）符合快速膿毒癥相關器官衰竭評分（Quick Sepsis-Related Organ Failure Assessment）中呼吸頻率≥22次/min、意識改變、收縮壓≤100 mm Hg（100 mm Hg=0.133 kPa）至少2項者［8］。29例患兒的29份標本（外周血標本27份，胸水標本2份）進行傳統病原體培養；同時送另外29份標本（外周血標本27份，胸水標本2份）進行mNGS病原體檢測。該研究通過醫院倫理委員會批準（2021-K-326-01），并獲得家長知情同意。

1.2 樣本處理和DNA提取

全血樣本以4 178 r/min離心10 min后取300μL血漿。使用TIANamp Micro DNA試劑盒（DP316，北京天根生化科技有限公司），根據試劑盒說明書提取DNA；胸水樣本取600μL經玻璃珠混合震蕩后，使用TIANamp Micro DNA試劑盒（DP316，北京天根生化科技有限公司），根據試劑盒說明書提取DNA。提取的DNA用作DNA文庫構建［9］。

1.3 文庫構建和測序

使用Agilent 2100 Bioanalyzer質控文庫插入片段大小，使用Qubit dsDNA HS試劑盒（Thermo Fisher Scientific，美國）質控DNA文庫濃度，經環化形成單鏈環形結構。環化后的文庫經滾環復制生成DNB納米球。制備好的DNB納米球加載到測序芯片，使用BGISEQ-50/MGISEQ-200/MGISEQ-2000進行測序［10］。

1.4 數據分析

測序數據下機后去除低質量的和長度小于35 bp的數據以獲得高質量數據。通過BWA（http://bio-bwa.sourceforge.net/）比對將高質量數據中人參考基因組序列的數據去除［11］。剩下的數據再去除低復雜度讀長（reads，最低檢測限是100 copies/mL）后與專用細菌（6 350種）、真菌（1 064種）、病毒（4 945種）、寄生蟲（234種）4個微生物大數據庫（深圳華大基因自建數據庫）比對，獲得能夠匹配到某種病原體的序列數，根據序列數的高低及臨床其他檢測來判斷可能的病原體。本研究設定樣本中微生物核酸的最低檢測限是100 copies/mL，低拷貝數微生物一律不納入致病微生物范圍，對于拷貝數大于最低檢測限的微生物檢測特異性大于99%，重復性大于99%。

1.5 收集資料

收集患兒的mNGS結果和臨床資料，包括性別、年齡、白細胞計數［正常值（4～10）×109/L］、血小板計數［正常值（100～300）×109/L）］、C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）（正常值≤8 mg/L）、降鈣素原（procalcitonin，PCT）（正常值≤0.5 ng/mL）、D-二聚體（正常值≤0.5μg/mL）、病原體培養結果、肺部影像學檢查結果、入院前使用抗生素及臨床轉歸等情況［12-16］。

1.6 統計學分析

應用統計軟件SPSS 20.0處理數據。偏態分布計量資料以中位數（四分位數間距）［M（P25，P75）］表示；計數資料以例數、百分率（%）或構成比（%）表示，率的比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征

29例重癥感染性疾病患兒中，男性15例（52%），中位年齡為3.0（2.0，7.0）歲；女性14例（48%），中位年齡為3.5（2.0，6.0）歲。6例（21%）患兒有基礎疾病（結締組織病2例，21三體綜合征合并先天性心臟病術后1例，心血管疾病2例，肝臟疾病1例），23例（76%）無基礎疾病，其中1例（3%）患兒有流行病學因素（浙江麗水龍泉人，就診于冬季，當地野鼠繁殖季節）。

2.2 血液和胸部影像學檢查結果

29例患兒中，白細胞計數低于正常值6例（21%），高于正常值13例（45%）；血小板計數低于正常值6例（21%），高于正常值14例（48%）；CRP高于正常值20例（69%）。26例完成PCT檢測，高于正常值16例（62%）。24例完成D-二聚體檢測，高于正常值23例（96%）。27例完成胸部X線片或CT檢查，提示肺部單側或雙側出現炎癥改變26例（96%）。

2.3 傳統病原體培養和mNGS結果情況

29例患兒的29份標本進行傳統病原體培養，2例（7%）患兒檢出2株病原體，其中表皮葡萄球菌1株，熱帶假絲酵母菌1株。29例患兒mNGS送檢29份標本，20例（69%）患兒有陽性結果，共檢出病原體38株，其中病毒占45%（17/38），細菌占42%（16/38），真菌占8%（3/38），其他占5%（2/38），見表1。

表1 29例患兒mNGS檢出38株病原體的情況

29例患兒經傳統病原體培養和mNGS明確診斷，25例最終治愈出院，救治成功率達86%；4例（14%）因起病急，病情重，最終救治無效死亡。

2.4 傳統病原體培養和mNGS檢出率比較

mNGS病原體檢出率高于傳統病原體培養［69%（20/29）vs 7%（2/29），χ2=23.727，P＜0.001］。送檢的54份外周血標本中，mNGS病原體檢出率高于傳統病原體培養（P＜0.05），見表2。

表2 外周血標本傳統病原體培養與mNGS病原體檢出率比較 ［例（%）］

2.5 影響mNGS檢出率的單因素分析

mNGS陽性組和mNGS陰性組性別、白細胞計數、血小板計數、CRP、PCT、D-二聚體、肺部影像學，以及入院前使用抗生素情況差異均無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 影響mNGS檢出率的單因素分析 ［例（%）］

3 討論

由于病原體的多樣性、復雜性和抗生素的不規范使用，導致臨床尤其是兒童危重癥感染性疾病的診斷和藥物選擇難度大大增加。目前臨床上有很大一部分重癥感染患兒臨床癥狀重，而多次傳統病原體檢測結果為陰性，所以急需要1種檢測手段輔助傳統病原體檢測方法，輔助臨床診治。在感染性疾病的相關臨床研究中，mNGS檢出率和靈敏度高于傳統病原體培養［17-19］。如在關節假體周圍感染的病原體檢出中，對比傳統病原體培養，mNGS可以提高病原體檢出率［20］。在診斷周圍型肺部感染性病變方面，mNGS靈敏度更高，能夠有效檢出傳統病原體培養陰性病例的病原體［21］。因此，mNGS可以克服臨床抗生素不規范使用的局限性，并且該技術靈敏度高，信息量大，我國已發布其在臨床急危重癥感染性疾病診療方面的專家共識［3］。

本研究29例患兒中，6例有基礎疾病。通常有基礎疾病的患兒在出現感染時易發生特殊病原體感染，該類患兒往往發病急，感染癥狀重，常規廣譜抗生素起效難，給臨床診斷和治療帶來極大的困難和挑戰。因此，對臨床重癥感染性疾病合并基礎疾病的患兒盡早找到病原體并予針對性治療意義重大。本研究發現mNGS對兒童重癥感染的病原體，尤其是細菌以外的病原體，如病毒、真菌，以及其他特殊病原體的檢出率明顯高于傳統病原體培養，與Greninger［22］研究結果類似。本研究中，mNGS檢出特殊病原體——恙蟲病東方體（立克次體科恙蟲病東方體屬）2株，該病原體引起的恙蟲病是一種自然疫源性急性傳染病，臨床表現通常無特異性，易漏診及誤診，會導致各臟器不同程度的損害［23-24］。大芬戈爾德菌、嗜胨菌、普氏厭氧球菌、解乳糖厭氧球菌均屬于革蘭陽性厭氧球菌，對營養要求高，傳統病原體培養中很難發現［25-26］，早期進行針對性藥物治療可改善預后。本研究通過mNGS檢出放線菌2株。放線菌需要在厭氧或微需氧環境培養，對臨床培養標本的接種時間要求嚴格，需要床邊接種［27-28］。mNGS直接從體液標本中提取DNA/RNA，取得送檢樣本中的生物基因信息，再與生物信息數據庫比對，獲得感染性疾病的病原體信息，對傳統檢測要求嚴格的病原體檢出率更高［29-30］。研究表明從基因組層面，mNGS為結核分枝桿菌檢測的重要方法，為其診斷提供依據［31］。同樣，本研究1例結核分枝桿菌感染患兒是通過mNGS明確診斷。因此，mNGS為感染病原體的明確帶來極大的幫助，特別是大大提高傳統病原體培養難以培養出致病微生物尤其是病毒及特殊病原體的檢出率。

單因素分析顯示，性別、白細胞計數、血小板計數、CRP、PCT、D-二聚體、影像學結果、入院前是否使用抗生素不會影響mNGS對病原體的檢出率。本研究中血培養陰性而mNGS陽性的12例細菌感染患兒，均在抽血前使用過抗生素，所以在入院前或者不明原因感染檢查前已經使用抗生素的患兒，mNGS對病原體的檢測更有優勢。這與成人感染性疾病的臨床相關研究［32］結果一致。有研究［33］發現，mNGS在中樞神經系統感染性疾病病原體診斷方面優于傳統病原體檢測，提示該技術對重癥感染具有優勢。

本研究29例重癥感染患兒25例最終治愈出院，救治成功率達86%。這與及時的mNGS應用有密切關系。在臨床上，對于感染患兒我們通常是先經驗治療，但是我們現在可以通過mNGS檢測后根據反饋的報告，及時改變診治方法，進行針對性抗感染治療。與此同時，mNGS能夠改善臨床抗生素濫用、誤用的情況。

綜上所述，兒童重癥感染性疾病疑難雜癥較多，診斷難度大，廣譜抗生素的長期使用效果差且易導致耐藥菌的產生。雖然mNGS費用較高，但在臨床危重癥診療中尤其對于傳統病原體培養陰性而臨床感染診斷不明的患兒，該檢測方法可擴大檢出范圍尤其是病毒及其他特殊病原體，提高檢出率，為早期臨床診療、有效避免病情進展提供有力的幫助。此外，很多重癥感染患兒存在混合感染，臨床醫生能夠根據mNGS檢出病原體序列明確病原體，采取更為完善的聯合治療。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。