新生兒重癥監護室金黃色葡萄球菌定植菌株的耐藥性及生物膜形成能力研究

李文婷 耿文靜 姚開虎 周婧婧 楊鑫 孫靜 馬香,*

(1 山東大學齊魯兒童醫院，濟南 250022；2 首都醫科大學附屬北京兒童醫院，北京 100045)

金黃色葡萄球菌作為一種機會性致病菌，可以引發一系列社區和醫院獲得性感染，也可以在人體的皮膚和黏膜無癥狀定植，鼻前庭是最主要的定植部位[1]。通常情況下，金葡菌的定植者是無癥狀的健康狀態，與細菌形成共生關系，但定植狀態會增加感染的風險[2-3]，報道顯示60%～93%的金葡菌感染起源于內源性定植菌株[4]。主動篩查金葡菌定植狀況并有針對的進行去定植治療可以降低相關感染的發生率、死亡率和醫療成本。據了解，我國目前針對住院患兒金葡菌定植的主動監測及感染防控措施較少，且定植的相關研究主要關注MRSA[5]，缺少MSSA的相關報道。前期本課題組已對北京兒童醫院NICU患兒鼻部金葡菌定植菌株的基因型和毒力特征進行了研究及報道[6]，發現ST59-IVa-t437和ST188-t189分別是MRSA、MSSA最常見的流行克隆，定植株的毒力基因攜帶率較高，為進一步了解我國NICU患兒的金葡菌定植菌株的耐藥譜及生物膜形成能力，本研究對MRSA及MSSA進行藥物敏感性實驗及生物膜形成能力檢測。

1 材料與方法

1.1 患者和鼻拭子標本

收集2015年5月20日—2016年3月20日北京兒童醫院新生兒重癥監護病房(NICU)住院的患兒病例，符合以下標準者納入本次研究：①年齡：出生至生后28 d；②入院時間＜24 h；③獲得父母或法定監護人的知情同意。具有以下則排除：存在可能會影響采取鼻拭子的情況(例如：重度呼吸窘迫和其它臨床醫師認定的因素)；父母或法定監護人不同意參加該調查。采集的鼻拭子標本暫時于-20℃低溫貯藏，冷凍狀態下轉運至北京兒童醫院微生物實驗室進行細菌分離培養和鑒定。

1.2 金葡菌的培養、鑒定及基因分型

通過菌落形態學、凝固酶試驗及nuc基因檢測對菌落進行金葡菌鑒定，采用頭孢西丁紙片(3Pg，Oxoid)法和mecA基因檢測篩查MRSA。頭孢西丁紙片法按照2014年美國臨床實驗室國家標準委員會(CLSI)標準判定[7]，抑菌環直徑≤21 mm為MRSA，≥22 mm為MSSA。前期實驗對分離株進行了進行多位點序列、金葡菌蛋白A基因及agr分型，對MRSA進行葡萄球菌染色體盒及其亞型分型[6]。

1.3 抗生素敏感性檢測

對頭孢西丁紙片法篩選出的MSSA，根據2014年CLSI制定的標準[7]采用E-test法檢測菌株對β-內酰胺類抗生素(青霉素、苯唑西林、頭孢呋辛、頭孢曲松)和非β-內酰胺類抗生素(利福平、復方磺胺甲惡唑、紅霉素、莫匹羅星)共8種抗生素的最低抑菌濃度(MIC)值；MRSA菌株除上述8種抗生素外，增加對美羅培南、萬古霉素、利奈唑胺、夫西地酸和替加環素的MIC檢測。莫匹羅星、替加環素、夫西地酸的敏感性依照歐洲抗菌藥物敏感性試驗執行標準[8]界定。質控菌株為ATCC29213。根據所測菌的MIC，計算MIC50及MIC90。

1.4 結晶紫染色實驗檢測生物膜形成能力

生物膜定量檢測參照結晶紫染色實驗[9]。菌株在含0.25%葡萄糖的TSB液中37℃過夜培養，調整菌液濃度為McFarland等級0.5濃度(～1.5×108CFU/mL)，并在含0.25%葡萄糖的TSB中稀釋至最終濃度106CFU/mL。在無菌96孔細胞培養板中37℃培養48 h。棄去培養液并用0.9%氯化鈉輕輕洗滌3次，并用甲醇固定15 min。風干后，將孔用0.1%結晶紫染色5 min，再用無菌PBS洗滌3次，自然風干，隨后于33%冰乙酸中作用 30 min，590 nm條件下用酶標儀測定培養孔中溶液的吸光度值(A值)，平行3個重復，計算其平均值。以未接種菌的培養液作為陰性對照，A值反映生物膜與接觸表面黏附的牢固程度，依據臨界Ac值(Ac是由空白孔的平均值加上其3倍的標準差)，可將生物被膜分成以下4類：A≤Ac為不黏附(0)，Ac＜A≤2Ac為弱黏附(+)，2Ac＜A≤4Ac 為中等黏附(++)，A＞4Ac為強黏附(+++)。

1.5 統計學分析

應用WHONET 5.6軟件錄入數據并進行敏感性分析。采用SPSS19.0 軟件進行統計分析。兩組間中位數比較用秩和檢驗。率的比較用卡方檢驗或Fisher's確切概率分析。P＜0.05 時，表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 金葡菌的培養與鑒定

536份鼻拭子標本共分離出金葡菌96株，NICU新生兒鼻前庭金葡菌的定植率為17.9%，其中 MRSA有28株(29.2%)，MSSA 68株(70.8%)。MRSA均為mecA陽性，且頭孢西丁抑菌環≤21 mm。

2.2 抗生素敏感性檢測結果

2.2.1 MRSA與MSSA藥敏結果

如表1所示，所有的MRSA菌株對青霉素耐藥，對苯唑西林耐藥率為57.1%，中介率28.6%，有4株(14.3%)為苯唑西林敏感甲氧西林耐藥金葡菌(OS-MRSA)。對頭孢曲松的耐藥率為78.6%，中介率14.3%。MRSA對紅霉素耐藥率為92.9%，對夫西地酸耐藥率3.6%，對其他抗菌藥物包括慶大霉素、利福平、復方磺胺甲惡唑、莫匹羅星、左氧氟沙星、美羅培南、萬古霉素、利奈唑胺及替加環素均敏感。在所有MSSA菌株中，對青霉素的耐藥率為82.4%，對頭孢曲松耐藥率為8.8%，對紅霉素耐藥率47.1%，中介率27.9%，對慶大霉素的耐藥率為16.2%，對其余抗菌藥物包括苯唑西林、利福平、復方磺胺甲惡唑、莫匹羅星及左氧氟沙星均敏感。

表1 藥物敏感性檢測結果Tab.1 Antimicrobial susceptibility test results

MRSA與MSSA在9種抗菌藥物不敏感率比較中，MRSA對苯唑西林、頭孢曲松和紅霉素的不敏感率顯著高與MSSA，差異有統計學意義。

2.2.2 OS-MRSA藥物敏感性

28株MRSA中檢測出4株OS-MRSA，檢出率為14.3%，4株均經菌落形態學、凝固酶試驗及nuc基因驗證確定為金葡菌，多重PCR驗證均含有mecA基因，頭孢西丁紙片法抑菌環直徑均≤21 mm。在4株OS-MRSA中，ST59-IVa-t437(3/4)為最常見的流行克隆，另有一株ST22-V-t309。4株菌株對頭孢西丁耐藥，其抑菌環直徑分別為16、17、16和18 mm，對苯唑西林均敏感，MIC值分別為1.5、1、2和2 mg/L。同時耐青霉素(MIC 4～＞32 mg/L)和頭孢曲松(MIC 6～＞32 mg/L)。3株OS-MRSA對紅霉素耐藥，1株對紅霉素中介(表2)。

表2 OS-MRSA分子特征與藥物敏感性Tab.2 The molecular characteristics and antibiotic resistance of oxacillin-susceptible mecA-positive S.aureus

2.3 生物膜形成能力檢測

2.3.1 MRSA與MSSA菌株生物膜形成能力的比較

根據結晶紫實驗結果，96株金葡菌中有88株(91.7%)為生物膜陽性，8株(8.3%)為生物膜陰性。MRSA、MSSA 的生物膜陽性率分別為89.3%(25/28)、92.6%(63/68)。將 88株金黃色葡萄球菌形成生物被膜的能力分為強(+++)、中等(++)、弱 (+)三組，其中強產膜菌株、中產膜菌株和弱產膜菌株分別為有21株(23.9%)、 62株(70.5%)、5株(5.7%)。其中，25株生物膜陽性MRSA菌株中1株(3.6%)為強產膜菌株，24株(85.7%)為中產膜菌株。63株生物膜陽性的MSSA菌株中，強、中、弱產膜菌株分別5株(7.4%)、38株(55.9%)、20株(29.4%)。MRSA和MSSA在生物膜形成能力方面沒有顯著差異(P=0.66)(圖1)。

2.3.2 不同ST型菌株生物膜形成能力的比較

25株生物膜陽性的MRSA菌株中，96%(24/25)的ST59菌株、95.8%(23/24)的SCCmec-IV菌株和90.5%(19/21)的spa-t437菌株能形成中等以上生物膜。不同基因型的聯合分析表明，ST59-SCCmecIVt437克隆菌株中有83.8%(19/20)為中等以上生物膜形成菌。進一步比較不同ST型的生物膜形成能力，發現它們之間存在顯著差異(P=0.0276)(表3)，其中ST188與其他型別之間存在顯著差異(P=0.0254)，其余任兩組之間沒有顯著差異(圖2)。

表3 生物膜形成能力Tab.3 The biofilm formation ability

2.3.3 產膜菌株與非產膜菌株的耐藥率

對比產膜菌株與非產膜菌株的藥敏情況，生物膜陽性菌株對青霉素、苯唑西林、慶大霉素、頭孢曲松和紅霉素的耐藥率分別為87.5%、15.9%、12.5%、21.6%和60.2%。生物膜陰性菌株對青霉素、苯唑西林、頭孢曲松、紅霉素的耐藥率分別為7.5%、25%、37.5%和62.5%，而對慶大霉素均敏感，但藥敏差異不存在統計學意義(表4)。

表4 產膜菌株與非產膜菌株的藥敏比較Tab.4 Comparison of the antimicrobial susceptibility between biofilm-forming and non-biofilm-forming isolates

3 討論

MRSA所引發的感染可呈散發或暴發流行，常常治療困難，且病死率較高，對MRSA的藥物敏感性監測顯得尤為重要。本研究藥敏顯示，除青霉素、苯唑西林、紅霉素和頭孢曲松外，MRSA對其他抗菌藥物均保持敏感, 尤其是對慶大霉素、復方磺胺甲惡唑、利福平和左氧氟沙星的敏感性，顯著高于兒童MRSA感染株的藥敏報道[10]，也高于同期國內其他MRSA藥物敏感性的報道。蔣漓麗等[11]報道MRSA 對慶大霉素、左氧氟沙星耐藥率均大于75% ,對復方磺胺甲惡唑稍敏感，耐藥率仍達39.6%。吳宇等[12]報道MRSA除對青霉素、苯唑西林、紅霉素耐藥率較高外，對慶大霉素、左氧氟沙星耐藥率也均高于80%。菌株來源、克隆群構成差異可能是產生不同研究結果的原因。2017年CHINET細菌耐藥性監測報道[13]，MSSA對青霉素、紅霉素和慶大霉素的耐藥率分別為89.9%、53.3%和11.9%。本研究中MSSA對青霉素、紅霉素和慶大霉素的耐藥率分別為82.4%、75%和16.2%，與同期國內情況基本一致。整體而言，相比兒童感染分離株，本研究中定植金葡菌尤其是MRSA，除對青霉素、紅霉素及頭孢類耐藥仍較高，對其他抗生素敏感性較好，可能得益于近年來臨床合理用藥等措施。

近年來，很多國家或地區逐漸報告了OS-MRSA菌株，巴西[14]和印度[15]OS-MRSA的在金葡菌中的比例高達33.7%和14.68%。我國1項10個城市2068株金葡菌的篩查中，廣州、武漢OS-MRSA檢出率高達35%、18%[16]，該報道中CC59-SCCmecV-t437是OSMRSA 的主要克隆型，本研究中4株OS-MRSA中3株為ST59-SCCmecIV-t437，但克隆的基因環境與OSMRSA的相關性仍有待進一步研究。

本研究金葡菌的生物膜陽性率高達91.7%，明顯高于Neopane等[17]報道的69.8%及我國覃金球等[18]報道的51.72%。覃金球等[18]和Yang等[19]發現MRSA產膜能力強于MSSA，本研究及Naicker等[20]并未發現兩者在產膜方面存在明顯差異，但MRSA和MSSA的生物膜形成機制的確不同，MSSA菌株形成生物膜由細胞間多糖抗原介導，而MRSA菌株生物膜形成則與細胞外DNA、錨定蛋白等相關[21]。值得注意的是，OS-MRSA生物膜的形成機制與MRSA不同，且β-內酰胺類抗生素可誘導OSMRSA生物膜的形成[22]，臨床治療時需予以重視。此外，Naicker等[20]發現MLST-CC5可能與高生物膜形成有關。本研究中，83.8%的ST59-SCCmecIVt437克隆株中有中等以上生物膜形成菌，ST188亦較其他型具有較強生物膜形成能力，優勢克隆的強生物膜形成能力可能是其在我國流行廣泛的部分原因。覃金球等[18]研究表明，產膜菌與非產膜菌比有更高的耐藥率，本研究及Brahma等[15]研究并未發現生物膜形成能力與藥物敏感性的關聯，研究表明，生物膜是通過改變內部微環境、被膜菌的表型變異、基質屏障、主動外排系統以及群體感應系統等機制對抗藥物的殺菌作用，因而體外實驗存在較多局限性。

本研究提供了近一年的NICU金葡菌定植率及定植菌株的耐藥性及生物膜形成能力，尚沒有對定植患兒進行前瞻性觀察，還不能回答定植者在后續住院過程中發生感染的概率及感染類型等情況，未來還需進一步開展研究，明確金葡菌定植與感染的相關關系，為制訂臨床干預措施提供參考，對預防和控制菌株播散或暴發等具有重要意義。