基于網絡藥理學探討黃芪桂枝五物湯治療產后身痛的作用機制

陳夢雪，高波，邊安政，邵馨樂，王文東

淄博市婦幼保健院，山東 淄博 255000

產后身痛，又稱“產后關節痛”“產后風”“產后痹”“產后風濕”等，是指產婦在產后出現肢體或關節沉重、疼痛、酸脹、屈伸不利等癥狀[1-2]。該病臨床癥狀復雜多變，除常見的四肢關節肌肉不適癥狀外，還可合并有心煩失眠、自汗盜汗、畏寒乏力等癥狀，相關實驗室檢驗及影像學檢查結果多未見異常[3]，因癥狀表現缺乏特異性而常常被臨床忽視。該病癥狀較輕的患者經適當調養多預后良好，但少數癥狀較重的患者可因治療不及時導致經久不愈，給患者生理及心理造成巨大傷害[4]。現代醫學認為，本病起病可能與雌激素水平急劇變化、骨質疏松、自身免疫性因素、骶髂關節紊亂、產后恥骨分離等多種因素有關[5]。目前，也有西醫學者認為本病多為產后抑郁導致的功能性風濕病，采用抗焦慮抑郁藥物治療[6]。

黃芪桂枝五物湯出自《金匱要略》，具有益氣溫經、活血通痹、止痛的功效。臨床研究證實，本方加減治療產后身痛具有很好的療效[7-8]。產后身痛因生產過程中真元大損，氣血空虛，發病多以氣血虧虛為本，《素問·調經論》載：“氣血不和，百病乃變化而生。”國醫大師周仲瑛教授認為，氣虛虧虛為發病基礎，在此基礎上的營衛不和為發病的關鍵，故臨床上多用黃芪桂枝五物湯加減以補益氣血、調和營衛。黃芪桂枝五物湯治療產后身痛的相關機制并不明確，因其藥物成分較多、靶點作用過程復雜，具體基礎實驗研究的開展存在困難。故本研究希望能通過網絡藥理學的方法分析黃芪桂枝五物湯治療產后身痛的作用靶點和通路，將其多成分、多靶點的復雜藥理學作用機制通過直觀的圖像及數值體現出來，為后續相關研究的開展提供參考。

1 資料與方法

1.1 黃芪桂枝五物湯活性成分收集和活性成分靶點篩選在TCMSP數據庫[9](http：//tcmspw.com/tcmsp.php)以“黃芪”“桂枝”“白芍”“生姜”“大棗”為關鍵詞檢索化合物的有效成分和基本信息，篩選滿足口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，藥物相似性(drug likeness，DL)≥0.18[10]的化合物成分及其相關靶點。將相關靶點帶入Uni-Prot數據庫[11](https：//www.uniprot.org)篩選人源靶點以及標準化靶點信息，將每種成分對應的靶點信息通過EXCEL軟件以表格形式保存。

1.2 產后身痛相關靶點篩選以“postpartum pain”“girdle pain”“low back pain”“pelvic girdle pain”“lumbopelvic pain”“postpartum chronic pain”“sacroiliac joint pain”等為關鍵詞在OMIM數據庫[12](https：//omim.org)檢索及合并去重后獲得產后身痛相關疾病靶點。

1.3 構建“藥物-成分-靶點”和“疾病-靶點”網絡關系圖分別建立單位藥活性成分與活性成分作用靶點、疾病與疾病靶點的相互作用關系，并分別將其導入Cytoscape 3.7.1軟件構建相應網絡關系圖，利用該軟件中的“Network Analyzer”工具對該網絡圖進行分析。

1.4 蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡構建與拓撲學分析利用STRING數據庫[13](https：//string-db.org)分別檢索活性成分靶點與疾病靶點基本數據及其關系，設置置信度>0.7[14]，物種為“智人(homo sapiens)”得到PPI關系數據結果，將結果借助Cytoscape 3.7.1軟件繪制PPI網絡，運用該軟件中的“Network Analyzer”工具對該網絡圖進行分析。

1.5 PPI網絡合并及關鍵靶點基因篩選運用Cytoscape 3.7.1軟件中Merge功能，將黃芪桂枝五物湯活性成分靶點的PPI網絡與相關疾病靶點的PPI網絡合并取交集獲得藥物作用潛在靶點[15]。

1.6 基因本體功能(gene ontology，GO)與京都基因與基因百科全書通路(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析運用DAVID 6.8數據庫(https：//david.ncifcrf.gov)，物種設置為“智人(homo sapiens)”，進行GO生物學過程富集分析和KEGG代謝通路富集分析，獲取生物學過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細胞組分(cellular component，CC)[16]和通路分析的數據，以圖表形式輸出。

1.7 活性成分與靶點分子對接在RCSB PDB數據庫[17](https：//www.rcsb.org)與Uni-Prot數據庫中檢索關鍵靶點并下載結構文件，在pubchem數據庫[18](https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)中下載關鍵化合物的結構文件。將結構文件導入PyMol 2.4.0和Auto Dock Tools軟件進行處理后進行分子對接，結構由PyMol 2.4.0軟件進行可視化處理，了解靶點蛋白質與活性成分的結合方式。

2 結果

2.1 黃芪桂枝五物湯活性成分篩選通過TCMSP數據庫，設置OB≥30%，DL≥0.18為篩選標準，共篩選出63個有效成分，相關信息見表1，由于化合物數量過多，表中僅展示OB值前15位的活性成分信息。

表1 黃芪桂枝五物湯主要活性成分

2.2 黃芪桂枝五物湯“藥物-成分-靶點”網絡關系圖的構建黃芪桂枝五物湯的活性成分在TCMSP數據庫中預測的靶點共1 099個，去重后得到靶點229個。將藥物、活性成分和預測靶點的信息導入Cytoscape 3.7.1軟件，構建“藥物-活性成分-靶點”網絡，見圖1。圖1中三角形節點代表藥物，橢圓形節點代表藥物成分，橢圓形節點顏色表示不用藥物來源，矩形節點代表成分相關靶點，線代表疾病與作用靶點之間的聯系。根據Degree值大小篩選出槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、山奈酚(kaempferol)等為藥物作用的關鍵化合物。

圖1 黃芪桂枝五物湯“藥物-成分-靶點”網絡關系圖

2.3 黃芪桂枝五物湯“疾病-靶點”網絡關系圖的構建在OMIM數據庫中檢索去重后共得到376個與產后身痛疾病相關的靶點。將疾病和預測靶點的信息導入Cytoscape 3.7.1軟件，構建“疾病-靶點”網絡，見圖2。圖2中菱形節點代表與產后身痛相關的疾病，矩形節點代表與疾病相關的作用靶點，線代表疾病與作用靶點之間的聯系。

圖2 黃芪桂枝五物湯“疾病-靶點”網絡關系圖

2.4 PPI網絡構建和拓撲學分析

2.4.1 活性成分作用靶點PPI網絡將229個化合物靶點輸入STRING數據庫中，將置信度設為0.7，蛋白相互關聯度為20，得到PPI關系文本和關系表格，將其導入Cytoscape 3.7.1軟件并繪制PPI網絡，見圖3。網絡中共246個靶點基因相互作用，1 613 條線表示各靶點蛋白間相互作用關系。以節點大小及顏色反映靶點的Degree值大小，線的粗細表示combine score值的大小。

圖3 活性成分作用靶點的PPI網絡圖

2.4.2 疾病靶點的PPI網絡操作方法同上，得到疾病靶點的PPI網絡，見圖4。網絡中共136個靶點基因相互作用，237條線表示各靶點蛋白間相互作用關系。以節點大小及顏色反映靶點的Degree值大小，線的粗細表示combine score值的大小。

圖4 疾病靶點的PPI網絡圖

2.5 PPI網絡合并及關鍵靶點基因篩選運用Cytoscape 3.7.1軟件中Merge功能，將黃芪桂枝五物湯活性成分靶點的PPI網絡與相關疾病靶點的PPI網絡合并取交集得到10個潛在靶點蛋白，分別為組織型纖溶酶原激活劑、干擾素調節因子1(interferon regulatory factor 1，IRF1)、纖溶酶原激活劑抑制劑1、氧化低密度脂蛋白受體1(oxidized low density lipoprotein receptor 1，OLR1)、載脂蛋白B-100(Apolipoprotein B-100，APOB)、中性粒細胞胞質溶膠因子1(neutrophil cytosol factor 1，NCF1)、核轉錄因子κB抑制劑alpha (nuclear factor-kappa B inhibitor alpha，NFKBIA)、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HMOX1)、信號轉導和轉錄激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)、轉錄因子p65(簡稱RELA)。其中，Degree值較大的靶點為STAT1、RELA、IRF1、NFKBIA。

2.6 GO和KEGG富集分析結果

2.6.1 GO功能富集分析利用DAVID 6.8數據庫進行GO功能富集分析，對合并網絡后的10個靶點蛋白在基因功能中的作用進行研究，以P<0.05為篩選標準，共得到BP 23個、MF 5個、CC 5個。其中，黃芪桂枝五物湯治療產后身痛的生物過程中位于前列的有RNA聚合酶II啟動子的轉錄正調控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、核苷酸結合寡聚結構域(nucleotide-binding oligomerization domain containing 2 signaling pathway)、凋亡過程(apoptotic process)、白細胞介素-12生物合成過程的正向調節(positive regulation of interleukin-12 biosynthetic process)、對病毒的防御反應(defense response to virus)；分子功能主要有蛋白結合(protein binding)、轉錄因子活性RNA聚合酶II核心啟動子序列特異性(transcription factor activity，RNA polymerase II core promoter sequence-specific)、酶結合(enzyme binding)、RNA聚合酶II核心啟動子近端區域序列特異性DNA結合(RNA polymerase II core promoter proximal region sequence-specific DNA binding)、NF-κB結合(NF-kappaB binding)；細胞成分主要有細胞液(cytosol)、I-κB/NF-κB復合物(I-kappaB/NF-kappaB complex)、核染色體(nuclear chromatin)、細胞質(cytoplasm)、細胞外間隙(extracellular space)。具體結果見圖5、表2。由于篩選所得生物學過程條目較多，故根據P值排序，故僅選取P值最顯著的前5個條目以圖表形式表現。

圖5 預測靶點的GO分析圖

表2 黃芪桂枝五物湯治療產后身痛的相關GO富集分析條目

2.6.2 KEGG通路富集分析將10個靶點導入DAVID 6.8數據庫進行KEGG通路富集分析，以P<0.05為篩選標準，共得到13條通路，見表3、圖6。并繪制出主要通路圖，見圖7。圖7通路為破骨細胞分化，圖中的矩形節點代表某一基因(蛋白質)，白色節點代表通路蛋白，綠色代表黃芪桂枝五物湯的關鍵作用靶蛋白STAT1、RELA、NFKBIA、NCF1，實線箭頭代表激活，虛線箭頭代表間接關系，兩個箭頭中間帶圈的表示表達。

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖

圖7 KEGG通路-破骨細胞分化圖

表3 黃芪桂枝五物湯治療產后身痛的相關KEGG通路分析

2.7 關鍵靶點與靶蛋白的分子對接結果將黃芪桂枝五物湯藥物關鍵活性成分和關鍵靶點進行分子對接，判斷其進入機體后能否與靶蛋白穩定結合。對接結果見表4，關鍵活性成分與關鍵靶點對接的親和力均小于-5.0 kj·mol-1[19]，結果表明，黃芪桂枝五物湯藥物關鍵靶點與靶蛋白有很好的結合性，研究的預測較為可靠。其中，山奈酚與RELA結合親和力最強，可視化分析結果見圖8。山奈酚化學結構用綠色表示，其他是RELA靶蛋白結構，TYR-285和UIS-252都是附近氨基酸殘基的名稱，由圖可見，山奈酚與活性位點附近的TYR-285和 UIS-252形成氫鍵結合到RELA。

表4 黃芪桂枝五物湯化合物與關鍵靶點對接信息表

圖8 山奈酚-RELA分子對接構象圖

3 討論

本研究篩選出槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚等化合物可能為黃芪桂枝五物湯治療產后身痛的重要成分。經研究發現，槲皮素具有顯著抑制小鼠手術引起的機械性痛覺異常[20]、減輕小鼠的氧化應激以提高骨性能[21]、抑制Wnt/β-catenin通路以減輕大鼠的神經病理性疼痛的功能[22]。β-谷甾醇具有與雌激素受體結合發揮雌激素或抗雌激素作用以調節骨代謝[23]、增加腦內去甲腎上腺素及其代謝產物減緩小鼠抑郁癥狀[24]的功能。山奈酚可通過炎癥反應、氧化應激等多種途徑發揮骨保護作用[25]。由這些藥物成分的作用機制可知，黃芪桂枝五物湯可改善患者身心癥狀。

黃芪桂枝五物湯治療疾病所涉及的主要基因靶點包括STAT1、RELA、IRF1、NFKBIA等。IRF1同干擾素調節因子家族的成員一樣，其N端包含了5個色氨酸殘基的DNA結合域，可形成的螺旋-轉角-螺旋基序并識別干擾素刺激響應元件，C端的關聯域可與其他同源或異質蛋白進行相互作用[26]。同時作為JAK-STAT信號傳導中的關鍵轉錄因子，IRF1可以誘導STAT1磷酸化，進而激活STAT1[27]。STAT是一類重要的胞質轉錄因子，STAT1通過JAK和MAPK激活使自身C端激活區保守殘基磷酸化，形成二聚體進入細胞核調節靶基因[28]。研究發現，成骨細胞中STAT1水平可影響RUNX2核轉位從而起到調節成骨細胞的功能[29]。RELA是NF-κB家族重要的成員，除同源結構域外，還具有特殊的反式激活結構域，該結構域通過募集共轉錄調節因子和基礎調節因子到靶基因調控下游基因轉錄。RELA翻譯后修飾具有精準調控NF-κB轉錄活性的功能[30]，NFKBIA通過與NF-kB的關聯分離和暴露保護來調節NF-κB的活性[31]，NF-κB是B細胞中提取的多功能核轉錄因子，可與染色體上κB序列特異性結合。NF-κB作為一種重要的轉錄因子，可參與到關節炎癥和組織破壞[32]，同時NF-κB也作為重要的下游信號分子在抑郁癥發病過程中發揮一定作用[33]。

富集分析顯示，黃芪桂枝五物湯治療疾病的主要通路包括破骨細胞分化、趨化因子信號通路、HIF-1信號通路等。由破骨細胞介導的骨吸收和由成骨細胞介導的骨形成共同完成骨代謝過程[34]。其中，破骨細胞過度活化可能會導致骨骼代謝疾病[35]，預測此過程可能是黃芪桂枝五物湯治療產后身痛的關鍵通路。研究發現，趨化因子受雌激素調控可在機體免疫調節中扮演重要角色[36]。其中，促炎因子白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α等可作用于下丘腦，引起HPA軸活化，參與產后抑郁發病的過程[37]。而產后抑郁又與產后身痛的產生、發展存在密切聯系[38]，推測此過程可能是黃芪桂枝五物湯調理患者身心健康的重要組成部分。HIF-1是一種異源二聚體，其亞基HIF-1α，能調節多種基因的表達[39]。HIF-1α/Notch信號通路能夠調節椎間盤中的細胞增殖、凋亡和代謝，并與椎間盤退變有關[40]。分子對接顯示，關鍵化合物成分和篩選出的關鍵靶點的靶蛋白具有較好的親和力，初步驗證了一部分研究結果。

綜上所述，黃芪桂枝五物湯中的槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚等化合物可能通過破骨細胞分化、趨化因子信號通路、HIF-1信號通路等通路，作用于STAT1、RELA、IRF1、NFKBIA等靶點治療產后身痛。但因網絡藥理學研究的條件限制[41]及相關疾病靶點收集不全面等因素影響，本研究結果存在一些不足，未來需繼續對無法客觀量化的中藥成分進入人體后的代謝轉換及其組織分布等進行深入研究[42]，細化研究方法，結合基礎實驗研究完善相關作用機制。