地紅方調(diào)控Keap1/Nrf2信號通路干預(yù)糖尿病血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激損傷的研究

何衛(wèi)東，楊柳清，林 姿，徐林詩，劉建帥

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州350004；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州350122）

糖尿病及其并發(fā)癥已成為嚴重危害人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題，其防治研究意義重大。氧化應(yīng)激損傷是糖尿病血管并發(fā)癥的重要發(fā)病機制，Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（kelch-like epichlorohydrin associated protein-1，Keap1）/核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）信號通路是調(diào)控糖尿病氧化應(yīng)激損傷的重要信號通路。中醫(yī)藥治療糖尿病及其血管病變有一定的優(yōu)勢，陰虛血瘀是消渴全病程的重要病機，地紅方具有滋陰活血的功效，臨床治療糖尿病效果顯著。因此，本課題通過體外細胞實驗，圍繞氧化應(yīng)激Keap1/Nrf2信號通路研究地紅方干預(yù)糖尿病血管內(nèi)皮細胞損傷的機制，為滋陰活血法在糖尿病及其血管并發(fā)癥的臨床應(yīng)用提供客觀依據(jù)，并為同類研究提供借鑒。

1 實驗材料

1.1 實驗動物和細胞 SPF級雄性SD大鼠50只，7周齡，體質(zhì)量（300±15）g，分籠飼養(yǎng)，自由攝水，溫度（23±2）℃，濕度50%～70%，通風良好，12 h光照明暗交替。人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（HUVEC），于恒溫37℃、5%CO2、95%濕度的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每1～2天更換MEM培養(yǎng)液1次；4～5 d細胞長滿后傳代，選擇第三代細胞用于實驗。

1.2 實驗藥物 地紅方藥物組成：熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、茯苓、牡丹皮、葛根、天花粉、桃仁、紅花、當歸、白芍、川芎、丹參。藥材均經(jīng)專業(yè)人員鑒定，不含重金屬。藥材先用5倍量清潔自來水清洗2遍，再以10倍量的蒸餾水浸泡0.5 h，用700瓦的火力煎煮1 h，過濾藥液；第2遍煎藥時加6倍量清潔自來水，同等火力煎煮40 min，再次過濾。將2次濾液合并，再以700瓦火力煎煮濃縮至1 g/mL濃度藥材的藥液（即1∶1藥液），無菌包裝，實驗備用。

1.3 實驗試劑 Keap1抗體、GAPDH抗體、HRPconjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（美國proteintech公司，批號：60027-1-Ig、60004-1-Ig、SA00001-1）。BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、Tris-Glycine-SDS電泳緩沖液、考馬斯亮藍染色液、考馬斯亮藍染色脫色液、Western專用一抗二抗稀釋液、無蛋白快速封閉液、超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用底物（武漢博士德生物工程有限公司，批號：AR0102、AR1178、AR0198、AR1112、AR0138、AR0139、AR0163-1、AR0163-2、AR1017、AR-0041、AR1111）。

1.4 實驗儀器 BCD-196TCSJ低溫冰箱（青島海爾股份有限公司產(chǎn)品）；DK-8D電熱恒溫水槽（上海一恒科技有限公司）；BSA124S電子天平［賽多利斯科學(xué)（北京）有限公司］；JXFSTPRP-48研磨機（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；WP-UP-YJ-10實驗室超純水機（四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司）；NYC-60轉(zhuǎn)移脫色搖床（泰州諾米醫(yī)療科技有限公司）；電泳儀、凝膠玻璃板、固定夾、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移槽（美國Bio-Rad公司）；Tanon-5200超高靈敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

2 實驗方法

2.1 實驗分組 傳代后的HUVEC以標準培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，更換培養(yǎng)液并隨機分為5個組，每組10個樣本。①正常組：葡萄糖濃度為5.6 mmol/L的MEM培養(yǎng)液加10%的無藥血清培養(yǎng)。②模型組：葡萄糖濃度為22.2 mmol/L的MEM培養(yǎng)液加10%的無藥血清培養(yǎng)。③低劑量含藥血清組（簡稱低劑量組）：在模型組基礎(chǔ)上培養(yǎng)6 h后，葡萄糖濃度為22.2 mmol/L的MEM培養(yǎng)液加5%含藥血清及5%無藥血清繼續(xù)培養(yǎng)。④中劑量含藥血清組（簡稱中劑量組）：在模型組基礎(chǔ)上培養(yǎng)6 h后，葡萄糖濃度為22.2 mmol/L的MEM培養(yǎng)液加7.5%含藥血清及2.5%無藥血清繼續(xù)培養(yǎng)。⑤高劑量含藥血清組（簡稱高劑量組）：在模型組基礎(chǔ)上培養(yǎng)6 h后，葡萄糖濃度為22.2 mmol/L的MEM培養(yǎng)液加10%含藥血清繼續(xù)培養(yǎng)。以上各組分組培養(yǎng)72 h后，分別收集細胞進行相關(guān)指標檢測。

2.2 Western blot檢測血管內(nèi)皮細胞質(zhì)內(nèi)Keap1蛋白表達 收集各組HUVEC細胞，BCA法測定蛋白濃度；經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后將載有蛋白的PVDF膜置于TBST溶液漂洗3次，5 min/次。漂洗后用封閉液室溫搖床孵育30 min，將膜置于一抗溶液中，置搖床室溫孵育2 h。使用TBST洗膜3次，10 min/次，將膜置于二抗中，37℃搖床孵育2 h，用TBST洗膜3次，10 min/次。用ECL化學(xué)發(fā)光顯色液，顯影讀片。

2.3 實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測血管內(nèi)皮細胞相關(guān)因子mRNA表達 采用qPCR法檢測血管內(nèi)皮細胞中Nrf2、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）、NAD（P）H：醌氧化還原酶-1（NQO1）和血紅素加氧酶-1（HO-1）的mRNA表達。收集各組HUVEC細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：50℃、15 min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85℃、5 s（反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)）；根據(jù)SYBR熒光定量PCR反應(yīng)體系進行PCR操作，反應(yīng)參數(shù)：95℃30 s，95℃10 s，60℃30 s，40個循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束后，通過ABI 7500熒光定量PCR儀進行數(shù)據(jù)處理。選擇Homo的GAPDH為內(nèi)參基因，依據(jù)實時定量PCR引物設(shè)計原則，根據(jù)Homo（NRF2，GST，SOD，CAT，GPX，GCL，NQO1，HO-1）的mRNA序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計目標基因和內(nèi)參基因的特異性引物，用Oligo 6.0檢驗其特異性。引物由上海博尚生物工程技術(shù)有限公司合成。引物序列為：GADPH F：5GGTGTGAACCATGAGAAGTATGA3，GADPH R：5GAGTCCTTCCACGATACCAAAG3；NRF2 F：5ATG CCACAGTCAACACAGATT3，NRF2 R：5GCCCATTTA GAAGTTCAGAGAGT3；GST F：5CAACGCCAAAGGT GAAGAAC3，GST R：5CGGTCAGAGCCAAATAACAT G3；SOD F：5ATTGCATCATTGGCCGCAC3，SOD R：5TCCCAATTACACCACAAGCCA3；CAT F：5TCTCA CCAAGGTTTGGCCTC3，CATR：5GCGGTGAGTGTCA GGATAGG3；GPXF：5AAGCTCATCACCTGGTCTCC3，GPX R：5CGATGTCAATGGTCTGGAAGC3；GCL F：5AGATTCCTGACCAGAACATTGATG3，GCL R：5CTG CTGTATTAAACCGTCCAACT3；NQO1 F：5GAAGAG CACTGATCGTACTGGC3，NQO1 R：5GGATACTGAAA GTTCGCAGG3；HO-1 F：5CTGCTGACCCATGACACC AA3，HO-1 R：5AGTGTAAGGACCCATCGGAGA3。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS 24.0進行分析，定量資料數(shù)據(jù)屬正態(tài)分布者以（±s）表示，非正態(tài)分布以中位數(shù)（四分位間距）即M（IQR）表示，多組定量資料數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布采用單因素方差分析，否則采用非參數(shù)檢驗。

3 結(jié)果

3.1 5組血管內(nèi)皮細胞Keap1蛋白表達比較 見圖1、表1。

圖1 5組血管內(nèi)皮細胞Keap1蛋白電泳圖

表1 5組血管內(nèi)皮細胞Keap1蛋白表達比較［（±s或M（IQR），n＝10）］

表1 5組血管內(nèi)皮細胞Keap1蛋白表達比較［（±s或M（IQR），n＝10）］

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

組別正常組模型組低劑量組中劑量組高劑量組Keap1 0.60±0.17 0.36±0.181）0.74±0.252）1.15±0.533）0.81（1.31）2）

3.2 5組Nrf2、GST、SOD、CAT、GPx、GCL、NQO1、HO-1的mRNA表達比較 見表2。

表2 5組Nrf2、GST、SOD、CAT、GPx、GCL、NQO1、HO-1 mRNA表達比較［（±s或M（IQR），n＝6）］

表2 5組Nrf2、GST、SOD、CAT、GPx、GCL、NQO1、HO-1 mRNA表達比較［（±s或M（IQR），n＝6）］

注：與正常組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與模型組比較，3）P＜0.05，4）P＜0.01；與中劑量組比較，5）P＜0.05。

組別正常組模型組低劑量組中劑量組高劑量組Nrf2 1.00±0.00 0.72±0.20 1.45±0.753）1.48（2.05）1）4）1.24（2.04）4）GST 1.00±0.00 0.51±0.02 1.36±0.083）5）2.16（0.37）2）4）1.66±0.241）4）SOD 1.00±0.00 0.48（0.04）1.40±0.163）5）2.21±0.262）4）1.80±0.181）4）CAT 1.00±0.00 0.52±0.02 1.46±0.134）5）2.23±0.282）4）1.68±0.221）4）GPx 1.00±0.00 0.51±0.02 1.43±0.103）5）2.06±0.272）4）1.73±0.161）4）GCL 1.00±0.00 0.57±0.08 1.23±0.164）1.87±0.222）4）1.47±0.331）4）NQO1 1.00±0.00 0.52±0.02 1.48±0.184）5）2.41±0.312）4）1.75（0.21）1）4）HO-1 1.00±0.00 0.52±0.05 1.47±0.184）5）2.25±0.182）4）1.73±0.271）4）

4 討論

國際糖尿病聯(lián)盟預(yù)測2030年全球糖尿病患者人數(shù)將達5.52億。如此大量的糖尿病患者不僅會使社會損失大量的勞動力，耗費大量財力和資源，而且嚴重影響經(jīng)濟和社會的發(fā)展。糖尿病及其并發(fā)癥已成為嚴重危害人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題，其預(yù)防及治療意義重大［1-2］。高血糖是誘發(fā)糖尿病患者血管內(nèi)皮細胞損傷和功能紊亂的始動因素［3］。血管內(nèi)皮損傷是高血糖和血管病變之間的連接樞紐［4］。糖尿病的血管并發(fā)癥，包括大血管并發(fā)癥如冠心病、腦卒中、外周大血管病變，微血管并發(fā)癥如糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病性心肌病等，在發(fā)病學(xué)上都與血管內(nèi)皮細胞損傷有密切關(guān)系［5］。

氧化應(yīng)激在糖尿病血管并發(fā)癥中具有突出的意義。糖尿病導(dǎo)致慢性并發(fā)癥的四條經(jīng)典途徑（蛋白質(zhì)非酶促糖化途徑、糖醇代謝紊亂途徑、G蛋白激酶途徑、果糖胺途徑）最終都與氧化應(yīng)激有關(guān)。無論是實驗性還是臨床性研究均表明：氧化應(yīng)激在糖尿病及其血管并發(fā)癥中起著至關(guān)重要的作用［6-8］。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）可促進細胞毒性的產(chǎn)生［9］。因此，抗氧化劑似乎是預(yù)防或治療氧化損傷的一種有效方法。據(jù)報道，已有維生素E等外源性抗氧化劑被用于治療人類心血管及腎臟疾病，雖然有些研究取得了一定的成果，但關(guān)于外源性抗氧化化合物對減少人類糖尿病并發(fā)癥的研究多以失敗而告終［10-11］。為此，發(fā)現(xiàn)并激活或上調(diào)內(nèi)源性抗氧化劑的有效藥物可能是預(yù)防或治療糖尿病及其并發(fā)癥更有效的方法。

近年來新發(fā)現(xiàn)的Keap1/Nrf2信號通路可清除細胞內(nèi)產(chǎn)生的過量ROS，從而對抗細胞內(nèi)的氧化損傷，在疾病預(yù)防和治療中具有積極的意義。因此，Keap1/Nrf2被認為是機體內(nèi)最重要的內(nèi)源性抗氧化信號通路，也是近幾年抗氧化研究領(lǐng)域的熱點。正常機體暴露于活性氧刺激時，Keap1蛋白中的活性半胱氨酸殘基結(jié)構(gòu)被改變，導(dǎo)致Nrf2從Keap1/Nrf2復(fù)合體中解離或者誘導(dǎo)Keap1發(fā)生構(gòu)象變化，使新合成的Nrf2免于被蛋白酶體降解，從而促進Nrf2由細胞質(zhì)向細胞核的轉(zhuǎn)移。在核內(nèi)，Nrf2與其他的轉(zhuǎn)錄因子（如小的Maf蛋白）形成異二聚體，促進Nrf2結(jié)合到位于啟動子區(qū)域的Nrf2靶基因（如順式調(diào)節(jié)因子ARE或親電子）反應(yīng)元件上，增加第Ⅱ階段解毒及抗氧化酶：GST、SOD、CAT、GPx、GCL、NQO1和HO-1等基因的表達［12-15］。Nrf2介導(dǎo)內(nèi)源性抗氧化物表達被認為是機體防御糖尿病引起氧化應(yīng)激損傷的重要機制［16］，一定程度上，過量的ROS可能促進糖尿病及其相關(guān)疾病的發(fā)生。高糖狀態(tài)下，細胞內(nèi)的葡萄糖氧化增加，線粒體產(chǎn)生過多的超氧化物引起組織細胞氧化應(yīng)激損傷，是引起糖尿病、胰島素抵抗和血管并發(fā)癥的重要原因。激活Keap1/Nrf2信號通路可減輕糖代謝異常引起的氧化應(yīng)激損傷而發(fā)揮其保護功能。

中醫(yī)藥治療糖尿病及其血管病變有獨特的優(yōu)勢。祖國醫(yī)學(xué)對消渴的認識和研究由來已久，已形成規(guī)范、成熟的理論并指導(dǎo)臨床實踐。消渴病的基本病機是陰虛為本、燥熱為標。近年來，隨著認識的深入，經(jīng)過臨床觀察證實瘀血也是消渴的病機之一［17-18］。因此，陰虛血瘀是消渴全病程的重要病機。滋陰活血法在臨床應(yīng)用中取得了較好的臨床效果，其相關(guān)作用機制值得研究并有益于指導(dǎo)臨床。地紅方由六味地黃湯、桃紅四物湯化裁而來，滋陰活血之力強，可用于治療陰虛血瘀型糖尿病。

本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型組Keap1蛋白表達較正常組明顯下降（P＜0.05），模型組Nrf2、GST、SOD、CAT、GPx、GCL、NQO1、HO-1的mRNA表達均較正常組有所下降；與模型組比較，低、中、高劑量組Keap1蛋白表達和Nrf2、GST、SOD、CAT、GPx、GCL、NQO1、HO-1的mRNA表達均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），而且以中劑量地紅方組最為突出，提示地紅方可能通過調(diào)控Keap1/Nrf2信號通路治療糖尿病血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激損傷。