恩格列凈對血糖波動糖尿病小鼠腎損傷的影響及其機制研究*

史麗，胡婷婷，李紅，張三明，劉智慧，左惠玲，胡利梅，任衛東

（1.河北北方學院附屬第一醫院內分泌科，河北張家口075000；2.河北北方學院附屬第一醫院國際醫療部，河北張家口075000；3.張家口市衛生健康項目管理中心，河北張家口075000；4.河北北方學院附屬第一醫院核醫學科，河北張家口075000）

糖尿病是一種糖脂代謝紊亂性疾病。不按時吃藥、患者心態較差、不合理飲食等都可引起糖尿病患者血糖波動。近年來越來越多研究證實，血糖波動越大的患者發生糖尿病并發癥，如糖尿病腎病（diabetic nephropathy,DN）、糖尿病視網膜病變等風險越高[1-2]。DN 是2 型糖尿病主要并發癥之一，是一種全身性微血管病變，能夠引起漸進性腎功能損害，甚至引起嚴重腎衰竭，而血糖波動能夠加重DN 腎損傷[3]。目前血糖波動對DN 腎損傷的影響機制尚未闡明，臨床也仍缺乏治療DN 的特效藥。因此探究血糖波動加速腎損傷的作用機制，尋找新的治療靶點和靶向治療藥物仍是臨床研究熱點。蒲閱麗等[4]研究顯示，恩格列凈可能通過抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD 細胞焦亡通路，改善糖尿病小鼠腎損傷。但目前有關恩格列凈對血糖波動糖尿病小鼠腎損傷的影響報道較少，因此本研究探究恩格列凈通過Caspase-1 介導的焦亡通路對血糖波動糖尿病小鼠腎損傷的影響，為臨床尋找有效治療靶點和靶向治療藥物提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

30 只4 周齡SPF 級SD 雄性小鼠，體重20～30 g，平均（25±5）g，購自北京北生研生物制品有限公司。實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0012，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2021-0262。

1.2 主要材料與儀器

鏈脲佐菌霉素（Streptozotocin,STZ）購自合肥博美生物科技有限責任公司， 蘇木精- 伊紅（Hematoxylin-eosin,HE）染色試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司，白細胞介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒購自北京伊塔生物科技有限公司，尿微量蛋白試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司，兔抗鼠NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD-N、β-actin 抗體及山羊抗兔HRP 二抗均購自上海經科化學科技有限公司。

ACCU-CHEK Advantage Ⅱ型血糖儀購自北京中西遠大科技有限公司，7150 型生化自動分析儀購自日本Esco 公司。

1.3 方法

1.3.1 動物模型的復制DM 模型的復制[5]：隨機選擇20 只小鼠禁食不禁水12 h，一次性尾靜脈注射STZ 溶液（40 mg/kg，以pH 4.5 的0.01 mol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液現用現配），72 h 后經尾靜脈檢測小鼠空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L 為DM模型復制成功。剩余10 只小鼠作為對照組，一次性尾靜脈注射等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液。

血糖波動性DM 模型的復制：小鼠DM 模型復制成功后1 周，于每天9：00、13：00、17：00 時間點腹腔注射葡萄糖溶液（250 g/L，0.4 mL），持續8 周，復制血糖波動性DM 模型。對照組小鼠同時間腹腔注射等量生理鹽水。

1.3.2 實驗分組將20 只血糖波動性DM 模型小鼠隨機分為血糖波動組、恩格列凈組，每組10 只。恩格列凈組小鼠于血糖波動性DM 模型復制結束后予以恩格列凈10 mg/（kg·d）灌胃，1 次/d，連續4 周[6]。對照組、血糖波動組小鼠同時間灌胃等量生理鹽水。

1.3.3 腎功能指標檢測于末次給藥前，收集并記錄24 h 尿量，3 000 r/min 離心10 min，離心半徑8 cm，取上清液，用全自動生化分析儀檢測24 h 尿蛋白。末次給藥結束后，用4%水合氯醛麻醉小鼠并處死，眼球取血，3 000 r/min 離心10 min，離心半徑8 cm，取上清液，于-80℃冰箱冷凍保存，用全自動生化分析儀測量血肌酐、血尿素氮水平。

1.3.4 標本采集及IL-1β水平檢測取血完畢后取雙腎組織[7]。①將左腎組織分為兩部分，一部分用4%多聚甲醛固定，乙醇脫水、透明、石蠟包埋過夜，連續切片（6 μm 厚），脫蠟、水化，進行HE 染色，以中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察腎組織病理學變化；另一部分制備組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，離心半徑8 cm，取上清液，采用ELISA 檢測IL-1β 水平，以上操作嚴格按照試劑盒說明書進行。②取右腎組織，保存于-80℃冰箱用于蛋白檢測。

1.3.5 Western blotting 檢測腎組織中焦亡通路相關蛋白分別取各組小鼠右腎組織制備組織勻漿，提取總蛋白并檢測濃度及純度，電泳，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h 后分別加入一抗NLRP3、Caspase-1、GSDMD、內參β-actin（1∶1 000），次日加入HRP 標記的山羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h，顯色，顯影，定影，根據蛋白條帶灰度值計算目的蛋白相對表達量[8]。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠腎組織病理學變化

對照組小鼠腎組織毛細血管腔內未見擴張，腎小管排列規則而緊密，腎小管上皮細胞形態正常，腎小球未見萎縮或肥大，基底膜和腸系膜無增厚。與對照組比較，血糖波動組小鼠腎小球體積增大，毛細血管基底膜明顯增厚，系膜基質增生，腎小管上皮細胞可見空泡化。與血糖波動組比較，恩格列凈組小鼠上述病理變化有所改善。見圖1。

圖1 各組小鼠腎組織病理學變化（×400）

2.2 各組小鼠腎功能指標比較

對照組、血糖波動組、恩格列凈組小鼠24 h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05）。進一步兩兩比較結果：與對照組比較，血糖波動組、恩格列凈組小鼠24 h 尿蛋白、血尿素氮、血肌酐水平升高（P<0.05）；但恩格列凈組小鼠24 h 尿蛋白、血尿素氮、血肌酐水平低于血糖波動組（P<0.05）。見表1。

表1 各組小鼠腎功能指標比較（n=10，±s）

表1 各組小鼠腎功能指標比較（n=10，±s）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與血糖波動組比較，P<0.05。

組別對照組血糖波動組恩格列凈組F 值P 值血肌酐/（μmol/L）40.15±6.06 83.29±12.52①50.38±7.58①②661.531 0.000 24 h尿蛋白/（mg/d）0.26±0.08 4.98±0.76①1.39±0.22①②617.061 0.000血尿素氮/（μmol/L）8.99±1.36 22.78±3.43①12.56±1.87①②659.379 0.000

2.3 各組小鼠腎組織IL-1β水平比較

對照組、血糖波動組、恩格列凈組小鼠腎組織IL-1β 分別為（15.09±2.27）pg/mL、（55.83±8.36）pg/mL 和（30.93±4.65）pg/mL，經方差分析，差異有統計學意義（F=665.569，P=0.000）。進一步兩兩比較結果：與對照組比較，血糖波動組、恩格列凈組小鼠腎組織IL-1β 水平升高（P<0.05），但恩格列凈組小鼠腎組織IL-1β 水平低于血糖波動組（P<0.05）。

2.4 各組小鼠腎組織NLRP3/Caspase-1/GSDMD細胞焦亡通路蛋白相對表達量比較

對照組、血糖波動組、恩格列凈組小鼠腎組織NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD-N 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05）。進一步兩兩比較結果：與對照組相比，血糖波動組、恩格列凈組小鼠腎組織NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD-N 蛋白相對表達量升高（P<0.05），但恩格列凈組小鼠腎組織NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD-N 蛋白相對表達量低于血糖波動組（P<0.05）。見表2 和圖2。

圖2 各組小鼠NLRP3/Caspase-1/GSDMD-N細胞焦亡通路蛋白的表達

表2 各組小鼠NLRP3/Caspase-1/GSDMD-N細胞焦亡通路蛋白相對表達量比較（n=10，±s）

表2 各組小鼠NLRP3/Caspase-1/GSDMD-N細胞焦亡通路蛋白相對表達量比較（n=10，±s）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與血糖波動組比較，P<0.05。

組別NLRP3蛋白對照組血糖波動組恩格列凈組F 值P 值GSDMD-N蛋白0.33±0.06 1.02±0.16①0.68±0.11①②500.811 0.000 0.15±0.03 0.47±0.08①0.31±0.05①②365.357 0.000 Cleaved caspase-1蛋白0.56±0.09 1.33±0.20①1.06±0.16①②582.680 0.000

3 討論

糖尿病是一種具有高致殘率、高病死率的慢性代謝紊亂性疾病，主要危害在于并發癥。DN 是糖尿病的主要并發癥之一，是長期代謝紊亂導致的全身性微血管病變，具有較高發病率及病死率[9]。有研究顯示，糖尿病患者由于胰島素分泌不足或功能缺失，易出現餐后血糖快速大幅度上升然后緩慢回落的情況，形成波動血糖，而血糖波動使糖尿病患者更易并發DN，加重腎損傷，增加病死率[10]。

恩格列凈是新型口服降糖藥，能通過減少腎小管對葡萄糖的重吸收來增加腎臟葡萄糖的排出，進而發揮降糖作用[11]。張瑜等[12]研究顯示，恩格列凈對2 型糖尿病伴慢性腎損傷患者的腎功能具有一定保護作用。何建芳等[13]研究顯示，恩格列凈對2 型糖尿病患者的血糖及腎功能有一定改善作用。血肌酐是人體肌肉代謝產物，其濃度變化主要由腎小球的濾過能力即腎小球濾過率來決定，濾過能力下降，則肌酐水平升高，反映腎臟受損。腎功能損傷的關鍵因素之一是分泌大量尿蛋白，其中24 h 尿蛋白是檢測尿蛋白的有效方式[14-15]。本研究結果顯示，與對照組比較，血糖波動組小鼠腎小球體積增大，毛細血管基底膜明顯增厚，系膜基質增生，腎小管上皮細胞可見空泡化，經恩格列凈藥物干預后，小鼠上述病理變化有所改善；與對照組比較，血糖波動組小鼠24 h 尿蛋白、血尿素氮、血肌酐水平均升高，但經恩格列凈藥物干預后，小鼠24 h 尿蛋白、血尿素氮、血肌酐水平均降低，說明恩格列凈可能對血糖波動性糖尿病小鼠腎損傷發揮保護作用。

有研究表明，炎癥反應在DN 發生、發展中發揮重要作用。既往有研究顯示，抑制炎癥因子IL-1β 等能改善DN 小鼠微炎癥狀態，改善腎臟病理損傷[16]。細胞焦亡是一種致炎性細胞模式死亡，主要依賴Cleaved caspase-1 介導的經典信號通路活化引起的一系列反應，最終作用于細胞，觸發細胞焦亡。NLRP3 是一種糖尿病狀態下表達上調的多蛋白復合物，其炎性小體可剪切Cleaved caspase-1，促使其活化，并進一步切割GSDMD 形成有活性的GSDMD-N，同時在腎小管細胞膜上聚合形成細胞膜微孔道，導致細胞焦亡及炎癥因子如IL-1β 等釋放，導致腎損傷[17]。趙為陳等[18]研究表明，高糖可誘導GSDMD 依賴性細胞焦亡，促使糖尿病腎損傷發生。本研究結果顯示，與對照組相比，血糖波動組、恩格列凈組小鼠腎組織NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD-N 蛋白相對表達量升高，但經恩格列凈干預后，小鼠腎組織NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD-N 蛋白相對表達量降低，說明恩格列凈對血糖波動性糖尿病小鼠腎損傷發揮保護作用，可能是通過抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路活化來實現的。

綜上所述，恩格列凈可能通過抑制Caspase-1通路活化，對血糖波動性糖尿病小鼠腎損傷發揮保護作用。然而本研究并未能明確恩格列凈對NLRP3/Caspase-1/GSDMD 通路的具體調控作用，后期應進行深入闡述。