載脂蛋白E4基因與阿爾茨海默病伴睡眠障礙患者血脂、炎癥因子及抑郁相關因子的關系*

肖英，閆麗敏，陳斌

（海南醫學院第二附屬醫院，海南海口570311）

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease,AD）屬于神經系統退行性疾病，又稱老年癡呆癥，起病緩慢，隨著時間延長病情可持續進展或惡化[1]。睡眠障礙是AD 患者較常見的并發癥，嚴重影響患者生活質量及身心健康。目前AD 伴睡眠障礙病變機制較為復雜，且尚未明確。既往研究表明，AD 患者睡眠質量降低與血脂代謝紊亂、炎癥及抑郁有一定關系[2-3]。載脂蛋白E（apolipoprotein E,ApoE）由299 個氨基酸構成，其基因多態性，尤其是ApoE4與AD 病變關系密切。近年來研究表明，ApoE4可促進血脂代謝紊亂，誘發炎癥反應，產生認知損傷而影響患者精神狀態[4-6]。目前AD 伴睡眠障礙相關研究較少。因此，本研究通過分析AD 伴睡眠障礙患者ApoE等位基因分布，探究ApoE4與AD 伴睡眠障礙患者炎癥因子、腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor,BNDF）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年6月—2020年7月在海南醫學院第二附屬醫院就診的78 例AD 患者，根據匹茲堡睡眠質量指數（Pittsburgh sleep quality index,PSQI）量表[7]將患者分為伴有睡眠障礙組（42 例，PSQI >7 分）及未伴有睡眠障礙組（36 例，PSQI ≤7 分）。其中伴有睡眠障礙組男性25 例，女性17 例；年齡60～85 歲，平均（72.19±10.04）歲；文化程度：高中以下29 例、高中及以上13 例。未伴有睡眠障礙組男性20 例，女性16 例；年齡62～88 歲，平均（72.51±12.03）歲；文化程度：高中以下25 例、高中及以上11 例。另取50 例同期該院健康體檢者作為健康組，男性27 例，女性23 例；年齡58～86 歲，平均（72.61±9.60）歲；文化程度：高中以下32 例、高中及以上18 例。3 組患者性別、年齡、文化程度比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審批，受試者均知情同意。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準①符合《2018 中國癡呆與認知障礙診治指南（一）：癡呆及其分類診斷標準》AD 診斷標準[8]；②年齡<90 歲；③臨床資料完整。

1.2.2 排除標準①在本實驗前3 個月內服用過抗精神類、安眠類藥物治療者；②心、肝、腎等臟器嚴重病變者；③胃食管反流、藥物濫用及慢性阻塞性肺疾病者，除AD 以外造成患者睡眠障礙的疾病；④內分泌代謝紊亂性疾病，如糖尿病、多囊卵巢綜合征、甲狀腺疾病等。

1.3 主要儀器及試劑

實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative realtime polymerase chain reaction,qRT-PCR）儀（上海力康生物醫療科技控股有限公司，型號CG-05），全自動生化分析儀（江西特康科技有限公司，型號TC6090L）。 酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒（美國貝克曼庫爾特公司）。

1.4 觀察指標

1.4.1 ApoE 等位基因分布從所有受試者靜脈血標本中提取DNA，設計及合成ApoE引物。ApoE正向引物：5′-CCTCTGCCC CGTTCCTTC-3′，反向引物：5′-CGCCACCTGCTCCTTCAC-3′，引物長度20 bp，由日本TaKaRa 公司設計合成。qRT-PCR 反應條件：95℃預變性15 min，94℃變性30 s，55℃退火2 min，65℃延伸45 s，共45 個循環。然后采用PCR 擴增其產物99℃、5 min，冰浴5 min，與基因芯片上特異性核酸探針進行雜交，測定基因位點序列。

1.4.2 血脂采用全自動生化分析儀檢測AD 伴睡眠障礙ApoE4 攜帶組及未攜帶組患者血脂水平，包括總膽固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（Triglyceride,TG）、低密度脂蛋白膽固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol,LDL-C）。

1.4.3 血清炎癥因子采用ELISA 檢測AD 伴睡眠障礙ApoE4 攜帶組及未攜帶組患者血清炎癥因子水平，包括腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白細胞介素6（Interleukin-6,IL-6）、白細胞介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）。

1.4.4 抑郁相關因子采用ELISA 檢測AD 伴睡眠障礙ApoE4 攜帶組及未攜帶組患者抑郁相關因子水平，包括BNDF、5-HT。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統計軟件。計數資料以構成比（%）表示，比較用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組ApoE等位基因分布

健康組、伴有睡眠障礙組、未伴有睡眠障礙組ApoE2、ApoE3 攜帶者占比比較，經χ2檢驗，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

健康組、伴有睡眠障礙組、未伴有睡眠障礙組ApoE4攜帶者占比比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（P<0.05）；其中伴有睡眠障礙組ApoE4攜帶者占比高于健康組和未伴有睡眠障礙組（P<0.05），而健康組與未伴有睡眠障礙組ApoE4攜帶者占比比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 ApoE等位基因的分布 例（%）

2.2 ApoE4攜帶組與未攜帶組患者血脂水平

由結果2.1 中可知AD 伴睡眠障礙患者中，14 例攜帶ApoE4基因（ApoE4 攜帶組），28 例未攜帶ApoE4基因（ApoE4 未攜帶組）。ApoE4 攜帶組與未攜帶組TC、TG 及LDL-C 水平比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P<0.05），ApoE4 攜帶組高于未攜帶組。見表2。

表2 ApoE4攜帶組與未攜帶組患者血脂水平比較（mmol/L，x±s）

2.3 ApoE4 攜帶組與未攜帶組患者血清炎癥因子水平

ApoE4 攜帶組與未攜帶組血清TNF-α、IL-6 及IL-1β 水平比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P<0.05），ApoE4 攜帶組高于未攜帶組。見表3。

表3 ApoE4攜帶組與未攜帶組患者血清炎癥因子水平比較（ng/mL，±s）

表3 ApoE4攜帶組與未攜帶組患者血清炎癥因子水平比較（ng/mL，±s）

組別ApoE4攜帶組ApoE4未攜帶組t 值P 值n 14 28 TNF-α 213.76±52.60 124.75±38.02 6.197 0.000 IL-6 122.41±30.05 72.49±12.38 7.655 0.000 IL-1β 57.11±10.24 32.39±6.54 9.519 0.000

2.4 ApoE4 攜帶組與未攜帶組患者抑郁相關因子水平

ApoE4 攜帶組與未攜帶組BNDF、5-HT 水平比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P<0.05），ApoE4 攜帶組低于未攜帶組。見表4。

表4 ApoE4攜帶組與未攜帶組患者抑郁相關因子水平比較（ng/mL，x±s）

3 討論

睡眠障礙是AD 常見并發癥，嚴重影響患者治療及生活質量[9]。ApoE 是一種通過介導膽固醇代謝的載脂蛋白，在動脈粥樣硬化及神經細胞功能中發揮重要生物學作用。本研究結果表明，伴有睡眠障礙組ApoE4攜帶者占比高于健康組及未伴有睡眠障礙組，而健康組及未伴有睡眠障礙組之間ApoE4分布無顯著差異。提示攜帶ApoE4的AD 患者更容易并發睡眠障礙，即ApoE4不僅是AD 致病的危險因素，而且可能增加AD 患者睡眠障礙發生風險。分析其原因可能為：①ApoE4致病機制與大腦中β 淀粉樣蛋白沉積有關，而β 淀粉樣蛋白沉積會對睡眠產生一定影響[10-11]；②可能與ApoE4對AD 患者血脂、炎癥因子及情緒相關因子的調節作用相關[12-14]。然而現階段ApoE4誘發AD 患者睡眠障礙的具體作用機制尚未明確。

胡雨亭等[15]研究報道，血脂水平異常對老年人認知功能有不利影響，TC、TG 及LDL-C 水平越高，認知能力越弱。且有報道證實，認知功能對患者睡眠障礙影響顯著，兩者相互作用[16-17]。為進一步探究血脂水平與睡眠的關系，馬愛娟等[2]研究發現北京人存在睡眠問題，認為其與TC、TG 及LDL-C 水平呈正相關。本研究結果表明，ApoE4 攜帶組TC、TG 及LDL-C 水平顯著高于ApoE4 未攜帶組。這一結果與賈新等[4]的研究結果類似，其發現攜帶ApoE4的AD 或輕度認知障礙患者血脂表達較未攜帶者更異常，認為ApoE基因的多態性與血脂水平密切相關。分析原因可能是ApoE4作為血漿中脂蛋白重要組分，參與脂蛋白代謝及膽固醇轉運，對患者血脂水平起到一定的調節作用，因而推測ApoE4通過調節患者血脂代謝來影響睡眠。

睡眠調節不僅與心理、神經及內分泌等因素有關，而且受細胞因子的影響。TNF-α、IL-1β 雖然是與免疫密切相關的炎癥因子，但是其受體也廣泛存在于腦干、海馬、下丘腦等與睡眠覺醒周期調節相關的大腦組織中，被認為與機體的生理性非眼球快速運動睡眠調節相關。有研究表明，TNF-α、IL-6、IL-1β 等炎癥因子表達上調可促進睡眠障礙[18]。低劑量TNF-α、IL-1β 可促進睡眠，高劑量則相反，可能是由于TNF-α、IL-1β 及其產物可以激活NF-κB 以延長滿波睡眠時間，而NF-κB 又可以增強TNF-α、IL-1β 的轉錄，在睡眠/剝奪中起到類似神經遞質的作用[19]。IL-6 是一種多功能細胞因子，健康人入睡前注射IL-6 可明顯縮短快動眼睡眠時間，白天易出現倦怠、精力不集中等表現，被認為參與了睡眠調節。本研究結果表明，ApoE4 攜帶組TNF-α、IL-6 及IL-1β 水平顯著高于未攜帶組。分析原因可能與ApoE4的促炎機制有關，國希云等[20]發現ApoE4可引發一系列炎癥反應，致使腦血管功能嚴重退化。因而推測ApoE4可增強AD 患者的炎癥反應，進而導致睡眠障礙。

AD 患者常伴有抑郁癥狀，且既往報道已證實抑郁癥狀對睡眠障礙影響顯著，如張樓鳳等[3]研究報道抑郁癥患者的睡眠質量與健康人存在顯著差異，且抑郁程度越重，患者睡眠障礙越嚴重。BNDF 屬于神經營養蛋白，動物實驗發現敲除BDNF基因的小鼠抑郁癥、狂躁癥發生率顯著高于健康小鼠[21]。BNDF 主要表達于大腦皮層、海馬、下丘腦等組織中，可維持神經元功能、促進神經元再生、參與突觸可塑性，當機體BNDF 表達降低時導致神經元凋亡增多，中樞神經系統突觸可塑性降低，進而引起抑郁、狂躁癥狀的出現[22-23]。本研究結果表明，ApoE4 攜帶組BNDF 水平顯著低于未攜帶組，提示ApoE4可能會抑制BNDF 的表達，BNDF 低表達則會導致抑郁癥狀的發生，而ApoE4抑制BNDF 的機制有待進一步研究。

5-HT 屬于哚衍生物，與人體睡眠、痛覺等生理功能相關，5-HT 水平升高可發揮抗抑郁作用。動物實驗發現，酒精依賴伴抑郁癥大鼠予以5-HT后，大鼠抑郁癥狀明顯緩解[24]。5-HT 是一種存在于人體血液、腸道、大腦等部位的神經遞質，其水平升高會導致機體中樞神經系統的慢波睡眠增多，覺醒減少；當其水平降低則可能導致失眠和情緒波動[25]。本研究結果表明，ApoE4 攜帶組5-HT 水平顯著低于未攜帶組，提示ApoE4可能會抑制5-HT 表達，5-HT 低表達會降低神經活動興奮度，影響大腦快速動眼睡眠，導致抑郁及睡眠障礙的發生，而ApoE4抑制5-HT 的機制仍有待進一步研究。

綜上所述，AD 患者并發睡眠障礙與ApoE基因多態性有關，其中ApoE4對該類患者影響最顯著，其原因可能與ApoE4調節患者血脂、炎癥因子及抑郁相關因子水平有關。然而本研究具有一定不足之處，后續研究可擴大樣本量及通過相關基礎實驗進一步明確其生物學作用機制。