葡萄球菌腸毒素蛋白的紅外光譜理論研究

劉永剛 楊云帆 唐 妍 徐建潔 劉 冰

(1. 西南科技大學分析測試中心 四川綿陽 621010； 2. 西南科技大學材料科學與工程學院 四川綿陽 621010； 3. 國民核生化災害防護國家重點實驗室 北京 102205)

隨著我國經濟的發展，城市人口越來越密集，以投放生物化學毒劑為主的恐怖襲擊將成為社會穩定和經濟發展的巨大隱患[1]。因此，從理論上研究毒劑分子結構和發展生化毒劑檢測技術成為重大事故后果分析的重要內容。定性地描述一個可能發生或正在發生的重大化學事故對人員和環境造成危害的程度，預測和評估危害后果，對突發危害性公共衛生事件的應急處置具有重要意義。

由分子光譜特性可知，不同的物質有不同的能級軌道，有其特定的精細結構，其表現出來的光譜性質是不同的，因此可利用分子光譜的特性來對物質進行甄別和鑒別，從而進行定性定量分析，故分子光譜亦稱為“指紋性光譜”。采用光譜學檢測方法檢測危險化學品具有采樣靈活、樣品無需前處理、分析速度快、甚至可以原位檢測等優點。這些特點使光譜法在檢測技術中占有重要地位，成為一種應用最廣泛的方法[2]。紅外光譜具有“靈敏度高”“指紋性強”“原位測定”等優點，在分析復雜化學物質組成及結構信息等方面有著廣泛的應用，特別是利用“紅外遙感”來實時監測大氣環境污染、無人區油氣田泄露等方面表現出紅外光譜技術的優越性，可對有毒有害物質進行“指認”[3-5]。隨著紅外光譜技術的發展，該技術在光譜學界越來越受到重視。

生物體系的毒劑由于其龐大且復雜的結構信息，僅通過實驗測定其光譜容易忽略一些重要的結構信息，計算模擬是對傳統實驗方法的一種補充，能夠了解一些通過傳統實驗手段不能得到的信息[6-8]。量子化學計算方法是在量子力學基礎上發展起來的與量子化學相關的計算方法[9-11]。隨著計算理論和計算機技術的不斷發展，計算模擬在光譜模擬分析領域的精確度越來越高，應用范圍也越來越廣，已經成為一種非常重要的研究光譜產生機理的方法[12]。

本文以葡萄球菌腸毒素蛋白為研究對象，通過分子動力學計算方法模擬該蛋白在不同溫度條件下的動態過程，并通過傅里葉變換方法建立大體系毒素分子的紅外光譜計算模型，模擬得到葡萄球菌腸毒素的紅外光譜，并分析其振動光譜與溫度之間的關系。

1 模型構建和模擬方法

分子動力學模擬計算充當了微觀長度、時間尺度和宏觀世界之間的橋梁(見圖1)，根據分子間相互作用提出假設，預測分子的“真實”綜合特性。在分子動力學模擬過程中可以根據“實際意想”的環境調整系統性質的準確性，此預測具有一定的“真實”性。模擬仿真方法也充當理論與實驗之間的橋梁。通過使用相同的模型進行模擬，可以測試理論的正確性，還可以模擬在實驗室中難以執行或無法執行的實驗(例如，需要在極端溫度或壓力下完成的實驗)[13-15]。對于大體系物質葡萄球菌毒素可采用分子動力學方法計算能量與時間的關系，并利用傅里葉變換得到紅外光譜[16-17]。

葡萄球菌腸毒素 B 蛋白的初始構象取自蛋白質結構數據庫(PDB號為3SEB)[18],該結構共有 238 個氨基酸，使用 Discovery Studio 軟件補充氫原子后共有3 921個原子。通過添加合適的水分子和其他離子來保證整個系統穩定且為電中性。在分子動力學模擬的整個過程中，僅記錄目標蛋白的運動和受力等信息，系統內添加的水分子和其他離子用于維持系統的穩定和目標蛋白的穩定構型，不會對計算目標蛋白的紅外光譜產生影響。對葡萄球菌腸毒素 B 蛋白系統采用Charmm 36 m力場的方法，共有66 080個原子，系統結構如圖 1 所示。

圖1 葡萄球菌腸毒素模型示意圖Fig.1 Schematic diagram of the staphylococcal enterotoxin model

對于分子動力學運動的計算，在給出所有的原子坐標ri和勢能函數U(rN)的情況下，接下來要做的是計算原子力fi，其定義式為：

(1)

首先通過能量最小化進行結構弛豫以保證葡萄球菌腸毒素B系統里面沒有立體幾何沖突或不當，在能量最小化的過程中采用最陡下降法(steep)進行5 000步能量優化，對于氫鍵位置使用 Lincs 方法進行約束。通過Nosw-Hoover的熱浴方法進行NVT(NVT為正則系綜簡寫，表示具有確定的粒子數(N)、體積(V)、溫度(T))系綜 125 ps 模擬，將體系溫度分別設定在254，264，274，299和314 K，模擬穩定系統的溫度，在每個穩定的溫度下均進行 125 ps 的分子動力學模擬。此時通過Parrinello-Rahman耦合的方法將系統的壓強穩定在1.05×105Pa，還需要在NPT(NPT為等溫等壓系綜簡寫，表示具有確定的粒子數(N)、壓強(P)、溫度(T))條件下進行模擬穩定系統的壓強，模擬時長為125 ps， 將系統的壓強穩定在1.05×105Pa。隨著兩個平衡階段的完成，系統現在已經處于目標溫度和壓強下，再進行時長為 1 ns 的分子動力學模擬(MD)，模擬步長為 2 fs，每隔 0.2 ps 記錄一次數據(坐標、能量、力和速度)。

記錄根據時間變化的總偶極矩信號，做自相關函數，然后做傅里葉變換，得到紅外光譜。公式為：

I(ω)n(ω)=量子校正系數×

(8)

式中：I(ω)為吸收強度；ω為頻率；M為體系的總偶極矩；〈M(t)·M(0)〉是體系總偶極矩的自相關函數；n(ω)是折射率。

2 結果與討論

對目標蛋白能量最小化后，將系統的溫度設定到各目標溫度并維持穩定。在最終 1 ns 的分子動力學模擬中，監測各溫度下系統的多種參數，結果如圖 2、圖 3 所示。

圖2 葡萄球菌腸毒素B系統溫度隨時間的變化Fig.2 Temperature changes of staphylococcal enterotoxin B system over time

圖3 不同溫度下葡萄球菌腸毒素B系統能量隨時間的變化Fig.3 Energy changes of staphylococcal enterotoxin B system over time at different temperatures

從圖 2 可知，葡萄球菌腸毒素 B 系統處于比較完美的目標溫度，其平均值和波動均在合理范圍內。圖 3 是不同溫度下葡萄球菌腸毒素 B 系統能量隨時間的變化曲線圖，系統在各溫度條件下能量都較為穩定，波動處于合理范圍內，并且從圖 3 可知平均能量與溫度成正比，即溫度越高，系統的能量越高。為研究葡萄球菌腸毒素 B 蛋白在不同溫度下的穩定性，分析了在模擬計算過程中蛋白質骨架相對于平衡結構的均方根偏差( Root Mean Square Deviation，RMSD)以及蛋白質回旋半徑(Rg)，結果如圖 4 和圖 5 所示[19]。

圖4 不同溫度下葡萄球菌腸毒素B系統RMSD隨時間的變化Fig.4 Changes of RMSD of staphylococcal enterotoxin B system over time at different temperatures

圖5 不同溫度下葡萄球菌腸毒素B蛋白質Rg隨時間的變化Fig.5 Changes of Rg of staphylococcal enterotoxin B protein over time at different temperatures

RMSD 反映了兩個結構間的偏離程度，該值越大，表明結構間差異越大；Rg表征了蛋白質的致密程度，在一定程度上體現了蛋白質在空間分布的延展性。圖4顯示，在不同溫度下，蛋白質骨架的 RMSD 在模擬初始階段(0～0.5 ns)均顯著增加，表明結構發生較大變化。隨著模擬時間進行，在 254，264，274，314 K溫度下，系統的 RMSD 均保持在較小恒定值(0.15 nm)附近。但是在 299 K 時，RMSD 最終保持在 0.275 nm 附近，說明溫度對葡萄球菌腸毒素B 蛋白結構的穩定性有很大影響。這也與圖 3 中溫度為 299 K 時系統的能量較高相呼應。在圖 5 中，溫度較低時(254 ，264 ，274 K)，Rg保持在一個恒定值，說明此時的蛋白質折疊穩定。在 314 K 時，其Rg也保持在一個相對恒定值，但是其波動漲落比低溫下更大。在 299 K 時，其Rg發生明顯變化，說明此時蛋白質處于一個展開不穩定狀態，這與前面分析一致。綜上所述，溫度對蛋白質結構穩定性有明顯影響，尤其是溫度為 299 K 時變化最明顯。

對上述系統再次進行不采用任何約束力的模擬，時長 200 ps，步長為 2 fs，每隔1步記錄數據(位置、力、能量和速度)，結果共有 200 000 個構象。然后使用 Gromacs 程序和傅里葉變換，記錄系統內目標蛋白的運動信息和偶極矩隨時間變化的曲線，然后做自相關函數的傅里葉變換，即將時間-偶極信號轉變為頻率-吸收強度信號，計算不同溫度下的紅外光譜，結果如圖 6 和表 1 所示。

對葡萄球菌腸毒素蛋白進行紅外光譜測定，對比實驗和理論結果。在干燥條件下稱取葡萄球菌腸毒素蛋白樣品 2 mg，按照質量比 1∶100 加入烘干的 KBr，用瑪瑙研缽研磨至細粉狀，壓片(將混合研磨后的樣品置于壓片夾內,壓力約為 10 MPa,壓片時間約為 60 s)后, 用 Frontier(美國PE公司)紅外光譜儀分析,分辨率 4 cm-1,以 KBr 為空白,并去除背景值,收集 4 000 ～ 500 cm-1范圍內光譜。

圖6 不同溫度下葡萄球菌腸毒素B蛋白質的紅外光譜與實驗紅外光譜Fig.6 Computational and experimental infrared spectroscopy of staphylococcal enterotoxin B protein at different temperatures

表1 不同溫度下葡萄球菌腸毒素B蛋白質的紅外光譜的峰值Table 1 Infrared spectrum peaks of staphylococcal enterotoxin B protein at different temperatures

表2 實驗與計算得到的葡萄球菌腸毒素紅外特征峰及其振動模式Table 2 Experimental and calculated infrared characteristic peaks and vibration modes of staphylococcal enterotoxin

3 結論

采用分子動力學方法對葡萄球菌腸毒素蛋白進行非簡諧振動分析計算，建立了生物大分子紅外光譜的理論計算模型，計算其特征峰位并研究了溫度對其穩定性及振動情況的影響，與實驗數據對比得到如下結論：通過分子動力學模擬了葡萄球菌腸毒素蛋白的動態過程，得到了不同溫度條件下系統的能量、均方根偏差(RMSD)和蛋白質回旋半徑(Rg)隨時間變化圖。分析得知葡萄球菌毒素平均能量與溫度成正比，即溫度越高，系統的能量越高，溫度對蛋白質結構穩定性有明顯影響。計算表明溫度對其高頻振動光譜影響更大。

利用此數據和理論實踐方法,后續擬將該模型應用于其他化學戰劑和危化品的近紅外光譜計算中，將大量的毒素低頻振動光譜收集成庫，即可以實現利用其光譜特征信號來實現對該類物質的分子識別和精確預警。