奈達鉑聯合吉西他濱阻滯非霍奇金淋巴瘤細胞周期促進細胞凋亡的作用研究

李云霞，趙 玲，趙明利，呂東津，郝 舒，吳 娜，周文鼎

（昆明醫科大學第三附屬醫院/云南省腫瘤醫院內三科1，微創介入科2，云南 昆明 650118）

非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）是由腫瘤細胞引起的惡性免疫系統疾病，主要表現為淋巴結病或實體瘤[1，2]。其分類復雜，世界衛生組織（WHO）已列出了50 多種不同的亞型的組織分類[3]。長期以來，非霍奇金淋巴瘤的標準一線化療方案為CHOP 方案，即環磷酰胺+多柔比星+長春新堿+潑尼松龍[4，5]。然而在一線治療后，有半數以上患者會轉化為復發難治性非霍奇金淋巴瘤，預后較差。針對這類患者的化療方案不統一，尚無標準治療方案[6，7]。有研究報道[8-10]，鉑類化療藥物和吉西他濱可用于非霍奇金淋巴瘤二線及以上的治療。有研究比較順鉑、吉西他濱和地塞米松聯合治療復發難治性非霍奇金淋巴瘤的效果，結果發現患者實現了較好的臨床應答并且安全耐受性良好[11]。奈達鉑是新一代的鉑類抗腫瘤藥物，與順鉑相比，具有更強的細胞毒作用，已在部分國家批準用于多種癌癥的治療[12]。因此，奈達鉑有望成為非霍奇金淋巴瘤化療的藥物選擇之一。本研究擬探索新型鉑類化療藥物奈達鉑和吉西他濱聯用抑制非霍奇金淋巴瘤細胞的作用機制，以期為臨床治療復發難治性非霍奇金淋巴瘤以及改善患者預后提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 MINO 和SU-DHL-4 非霍奇金淋巴瘤細胞株購自中國科學院細胞庫，使用RPMI-1640培養基（含10%胎牛血清，100 μ/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素），在含5%CO2的細胞培養箱中37 ℃下培養。PBS 粉末（索萊寶）完全溶解于2000 ml 蒸餾水中，混勻后，調整pH 值在7.2～7.4，備用。細胞周期和細胞凋亡檢測試劑盒購自ThermoFisher。FITC 標記的CDK1 和CDK4 抗體購自Abcam。

1.2 方法

1.2.1 MTT 細胞活力實驗 在96 孔板中分別接種兩種NHL 細胞，密度達到5000 細胞每孔，3 個實驗組分別加入4、2、1、0.5 和0.25 nM的吉西他濱和奈達鉑以及二者的混合物，另外沒有藥物處理的細胞作為對照組。培養72 h 后，吸去培養液，每孔加入100 μl的0.5 mg/ml的MTT 在培養箱種孵育4 h。然后棄液體并在每孔加入100 μl的DMSO，待結晶全部溶解，用酶標儀在490 nm 處測量吸光度值。每個濃度進行3 次平行重復實驗。

1.2.2 流式細胞儀（FCM）檢測細胞周期和細胞凋亡兩種NHL 細胞株接種在6 孔板中，以20 萬細胞/孔的密度接種，3 個實驗組的細胞分別用1 nM 吉西他濱、奈達鉑和奈達鉑+吉西他濱處理72 h，PBS 清洗3 次之后，使用細胞周期試劑盒進行標記，通過表征每個細胞的DNA 含量并用碘化丙啶（PI）染色進行分析。細胞凋亡實驗則在含有5 μl 異硫氰酸熒光素（FITC）標記的膜聯蛋白V 和5 μg/ml的PI的100 μl 鈣結合緩沖液中對1×105個完整細胞進行雙重染色，在黑暗中孵育15 min，然后通過流式細胞術（FACS）進行分析。

1.2.3 免疫熒光檢測細胞周期蛋白依賴激酶CDK1和CDK4的表達 兩種NHL 細胞株接種在玻璃底培養皿中，以50 萬細胞/孔的密度接種。3 個實驗組的細胞分別用1 nM 吉西他濱、奈達鉑和奈達鉑+吉西他濱處理72 h，棄培液，用PBS 清洗3 次，加入4%多聚甲醛溶液室溫固定15 min，重復PBS 清洗過程。用0.1%Triton X-100 處理5 min 后再次清洗。使用5%脫脂奶粉的TBST 封閉細胞在培養箱中孵育1 h 后，分別使用FITC 標記的CDK1 和CDK4 抗體進行標記，繼續在培養箱中孵育1 h，用TBST 清洗3 次之后在熒光顯微鏡下進行檢測。綠色熒光強度代表CDK1 和CDK4的表達量，比較奈達鉑組、吉西他濱組、奈達鉑+吉西他濱組和對照組的熒光強度。

1.3 統計學分析 實驗數據的分析處理采用Graphpad Prism 7.0 進行，計量資料以（）表示，行非配對Students't檢驗；計數資料以[n（%）]表示，行χ2檢驗；P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 奈達鉑組、吉西他濱組和奈達鉑+吉西他濱組細胞活力比較 奈達鉑組、吉西他濱組和奈達鉑+吉西他濱組均抑制兩種NHL 細胞株的增殖，其中奈達鉑+吉西他濱組抑制效果最顯著，且隨著藥物等比稀釋濃度逐漸降低，細胞活力的抑制率也逐漸降低；另外，奈達鉑組和吉西他濱組的抑制率在SU-DHL-4細胞株相較于MINO 中更低，見圖1。

圖1 不同藥物及濃度對MINO 和SU-DHL-4 非霍奇金淋巴瘤細胞增殖的抑制作用

2.2 奈達鉑組、吉西他濱組和奈達鉑+吉西他濱組細胞凋亡比較 圖2 和圖3 分別顯示奈達鉑組、吉西他濱組及奈達鉑+吉西他濱組在SU-DHL-4及MINO細胞中誘導凋亡的情況。4 個象限分別代表細胞的不同狀態，其中左下角表示正常細胞群，左上角是壞死的細胞群，右上角是早期凋亡細胞群而右下角為晚期凋亡細胞群。在未使用化療藥物處理的對照組中，大多數細胞群落入左下角象限。在SU-DHL-4細胞中，吉西他濱組10%左右的細胞出現早期凋亡，約20%的細胞發生壞死。而奈達鉑組和奈達鉑+吉西他濱組細胞主要發生晚期凋亡。在MINO 細胞中，奈達鉑組、吉西他濱組和奈達鉑+吉西他濱組細胞均發生早期和晚期凋亡。

圖2 奈達鉑和吉西他濱對SU-DHL-4 細胞凋亡的誘導作用

圖3 奈達鉑和吉西他濱對MINO 細胞凋亡的誘導作用

2.3 奈達鉑組、吉西他濱組和奈達鉑+吉西他濱組細胞周期阻滯比較 由圖4 和圖5 可知，對照組的腫瘤細胞一半左右處于G1期。在SU-DHL-4 細胞中，奈達鉑組44.5%的細胞處于S 期，吉西他濱組42.2%的細胞處于S 期，奈達鉑+吉西他濱組有52.3%的細胞處于S 期。在MINO 細胞中也得到類似的結果，奈達鉑組、吉西他濱組以及奈達鉑+吉西他濱組的細胞處于S 期的比例增加，其中吉西他濱組的S 期比例最高，達到50.9%。

圖4 奈達鉑和吉西他濱對SU-DHL-4 細胞周期的作用

圖5 奈達鉑和吉西他濱對MINO 細胞周期的作用

2.4 奈達鉑組、吉西他濱組和奈達鉑+吉西他濱組細胞周期蛋白依賴激酶CDK1 和CDK4的表達比較圖6 和圖7 分別顯示對照組和3 個實驗組的兩種NHL 細胞的CDK1 和CDK4 表達情況，熒光強度越強代表蛋白表達越多。對照組兩個細胞株的CDK1和CDK4的表達水平均最高，奈達鉑組和吉西他濱組的CDK1 和CDK4 表達降低，奈達鉑+吉西他濱組的CDK1 和CDK4的表達量最低，幾乎不顯示綠色熒光。

圖6 奈達鉑和吉西他濱調節MINO 細胞CDK1 和CDK4 表達

圖7 奈達鉑和吉西他濱調節SU-DHL-4 細胞CDK1 和CDK4 表達

3 討論

本研究使用MINO 和SU-DHL-4 兩種非霍奇金淋巴瘤細胞株，通過MTT 實驗證實奈達鉑和吉西他濱可以抑制兩種NHL 細胞株增殖，并且隨著藥物濃度增加，抑制增殖率也隨之增加。兩種藥物聯合使用相較于單一藥物抑制細胞增殖效果更加明顯。在此基礎上，兩種藥物也可以阻滯細胞周期，使更多比例的細胞發生G2-M 期阻滯。吉西他濱和奈達鉑可以誘導NHL 細胞進入早期凋亡和晚期凋亡，而聯合組的晚期凋亡比例進一步提高，提示聯合用藥可以進一步增強腫瘤細胞的凋亡。奈達鉑和吉西他濱誘導細胞周期阻滯通過下調CDK1 和CDK4的表達，免疫熒光結果顯示，奈達鉑聯合吉西他濱降低CDK1 和CDK4 表達幅度最顯著。

吉西他濱具有細胞周期特異性，主要殺死正在經歷DNA 合成（S 期）的細胞，也可以抑制進展細胞通過G1/S 間期。吉西他濱通過其兩種活性代謝物抑制DNA 復制和合成的多種作用機制發揮其細胞毒作用[13]。吉西他濱在治療各類NHL 中進行了廣泛的嘗試[14-16]。研究顯示[17]，在胰腺癌中，吉西他濱可以抑制腫瘤細胞增殖和引起S 期細胞周期阻滯，從而誘導細胞凋亡。本研究中，細胞周期實驗顯示吉西他濱誘導非霍奇金淋巴瘤細胞發生細胞周期阻滯，對照組細胞占比最高的處于G1期，而吉西他濱和奈達鉑處理后細胞周期最高占比由G1期轉化為S 期，這提示大部分細胞處于DNA 合成期，而吉西他濱正好作用于這一時期的細胞，發揮抑制腫瘤的作用。吉西他濱聯合鉑類化療藥物也是經典的治療方案選擇。有研究比較了吉西他濱聯合順鉑與吉西他濱聯合奧沙利鉑治療NHL的臨床療效，結果表明兩個方案的臨床有效性相當，但聯合奧沙利鉑具有更小的副作用和更好的安全耐受性[18，19]。部分臨床研究也探索了奈達鉑在NHL 中的使用。研究表明[20]，替莫唑胺、奈達鉑和長春新堿聯合使用治療原發性中樞神經系統淋巴瘤具有一定的潛力和安全性。Wang H 等[21]研究顯示奈達鉑處理耐藥細胞后凋亡率明顯增加，G2期細胞數也明顯增多。本研究探索了奈達鉑在NHL 中的機制研究，從細胞周期相關的通路驗證了奈達鉑可以抑制細胞周期相關蛋白的表達，誘導細胞凋亡。另外，奈達鉑+吉西他濱組的研究結果也顯示在NHL中奈達鉑和吉西他濱具有協同作用，提示兩種藥物聯合治療NHL 可能會取得更好的效果。

綜上所述，本研究從機制層面證實吉西他濱和奈達鉑通過下調細胞周期蛋白依賴激酶CDK1 和CDK4的表達，引起細胞周期阻滯，從而誘導非霍奇金淋巴瘤細胞凋亡，最終抑制細胞增殖，發揮殺傷腫瘤的作用。此外，吉西他濱聯合奈達鉑的效果優于兩者單一藥物。