介藜蘆堿調(diào)控miR-132-3p/FOXN3 軸抑制胃癌細(xì)胞遷移、侵襲機(jī)制研究

吳亞萍 馬君

胃癌是最常見(jiàn)的消化道腫瘤之一，其檢出率位居全球第五，死亡率僅次于肝癌和肺癌[1]。在中國(guó)，胃癌的發(fā)生率及死亡率均高于世界平均水平[2]。近年癌癥的治療手段不斷發(fā)展，但還是以手術(shù)治療為主。多數(shù)癌癥患者在診斷時(shí)已發(fā)生癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，患者的中位生存期約為1年[1，3]?；熓侵型砥诎┌Y患者的主要治療手段，但因化療藥物毒性及耐藥而大大限制了其臨床應(yīng)用和療效[4]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal tran-sition，EMT）是上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的生物過(guò)程，發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞具有侵襲性和遷移能力，腫瘤細(xì)胞的EMT 能力決定了多種類型的腫瘤惡性進(jìn)展[5]。研究表明，EMT 是胃癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素之一。介藜蘆堿是中藥藜蘆的重要單體成分，可以通過(guò)抑制非小細(xì)胞肺癌PI3K-AKT 信號(hào)促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生，從而抑制肺癌惡性進(jìn)程[6-7]。然而其在胃癌中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究將探討介藜蘆堿對(duì)胃癌的作用及相關(guān)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞系NCI-N87（批號(hào)CL-0169）購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 試劑 RPMI 1640 培養(yǎng)基（批號(hào)31800022）、胎牛血清（批號(hào)16000-044）購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司。Edu 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（批號(hào)C0085S）、結(jié)晶紫（批號(hào)C0121）購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Transwell 小室（批號(hào)3412）購(gòu)自美國(guó)corning 公司。Trizol 試劑購(gòu)于上海普飛生物科技有限公司。miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)638315）、定量PCR 試劑盒（批號(hào)RR820A）購(gòu)于日本Takara 公司。一抗（E-cadherin、Vimentin、ZO-1、β-actin 批號(hào)分別為3195、5741、13663、3700）均購(gòu)于美國(guó)CST 公司，細(xì)胞免疫熒光二抗（批號(hào)A-21072）購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 儀器 Ti-E 型熒光顯微鏡（日本尼康公司）；A1 HD25 型共聚焦顯微鏡（日本尼康公司）；BIORADXR 型成像儀（美 國(guó) Bio -Rad 公 司）；LightCycler480Ⅱ型熒光定量PCR 儀（Roche 公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將NCI-N87 細(xì)胞鋪板于96 孔板中，根據(jù)介藜蘆堿濃度不同，分為對(duì)照組（1%DMSO）、低劑量組（10μg/mL）和高劑量組（30μg/mL）。每組5 個(gè)復(fù)孔。將藥物按照上述劑量加入到對(duì)應(yīng)細(xì)胞中過(guò)夜培養(yǎng)，并按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)操作。Ti-E 型熒光顯微鏡下觀察拍照，利用image J 軟件統(tǒng)計(jì)Edu陽(yáng)性率。

2.2 細(xì)胞遷移以及侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞遷移分為對(duì)照組（%DMSO）、低劑量組（10μg/mL）、高劑量組（30μg/mL），每組3 個(gè)復(fù)孔。藥物處理24h 后，消化細(xì)胞，離心，無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將NCI-N87 細(xì)胞加入Transwell 上室。24h 后細(xì)胞取出，用棉簽將上室細(xì)胞拭去，顯微鏡下觀察結(jié)晶紫染色，拍照后利用image J 統(tǒng)計(jì)遷移細(xì)胞數(shù)。在Transwell 膜上涂抹基質(zhì)膠各組進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)。

2.3 細(xì)胞免疫熒光 實(shí)驗(yàn)分組同上，將各組NCIN87 細(xì)胞鋪板于24 孔板細(xì)胞爬片上，藥物處理24h后，加入一抗、二抗孵育，對(duì)NCI-N87 細(xì)胞進(jìn)行DAPI染色。使用共聚焦顯微鏡觀察拍照。

2.4 蛋白免疫印記 實(shí)驗(yàn)分組同上，各組細(xì)胞鋪板于6 孔板中，經(jīng)過(guò)藥物處理24h 后，利用1×loading 直接裂解NCI-N87 細(xì)胞蛋白，制作電泳樣品。經(jīng)過(guò)電泳-轉(zhuǎn)膜封閉后，進(jìn)行一抗、二抗孵育。加入化學(xué)反應(yīng)底物，利用成像儀進(jìn)行成像分析。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次獨(dú)立重復(fù)。

2.5 定量PCR 實(shí)驗(yàn)分組同上，各組細(xì)胞鋪板于6孔板中，藥物處理24h 后，trizol 提取NCI-N87 細(xì)胞RNA，RR036A、RR037A 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄mRNA 及miRNA。定量PCR 試劑盒檢測(cè)NCI-N87 細(xì)胞RNA表達(dá)水平。相關(guān)特異性引物序列如下：FOXN3：F-5'-ACTCTGACATGCCCTACGATG-3'，R-5'-TCTGACTCCTCTCTTTGTCCAC-3'；miR-132-3p：F-5'-CCAGCATAACAGTCTACAGCC-3'，R-5'-TATGGTTGTTCACGACTCCTTCAC-3'；U6：F-5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R-5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。GAPDH 及U6 分別為mRNA 及miRNA 的內(nèi)參。以上引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。反應(yīng)體系置于LightCycler480Ⅱ型熒光定量PCR 儀中檢測(cè)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組均數(shù)間比較行單因素方差分析，兩組之間比較采用LSD 檢驗(yàn)，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 介藜蘆堿對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果顯示，介藜蘆堿低、高劑量組胃癌細(xì)胞Edu 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 Edu 檢測(cè)介藜蘆堿對(duì)胃癌細(xì)胞NCI-N87 增殖的影響（400×）

3.2 介藜蘆堿抑制胃癌細(xì)胞遷移、侵襲 介藜蘆堿處理胃癌細(xì)胞24h 后，發(fā)現(xiàn)介藜蘆堿可以明顯抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲，并呈現(xiàn)劑量依賴性，低劑量即可減少胃癌細(xì)胞侵襲和遷移的數(shù)量，而高劑量效果更加顯著（見(jiàn)圖2）。統(tǒng)計(jì)侵襲和遷移的細(xì)胞數(shù)并計(jì)算相對(duì)遷移率和侵襲率結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，介藜蘆堿低、高劑量組胃癌細(xì)胞NCI-N87 的遷移率和侵襲率均顯著降低（P 均＜0.05）。見(jiàn)表1。

圖2 介藜蘆堿對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用（結(jié)晶紫染色400×）

表1 介藜蘆堿對(duì)胃癌細(xì)胞相對(duì)遷移率和侵襲率的影響（%，）

表1 介藜蘆堿對(duì)胃癌細(xì)胞相對(duì)遷移率和侵襲率的影響（%，）

注：對(duì)照組為NCI-N87 細(xì)胞未經(jīng)處理；低劑量組為10μg/mL 介藜蘆堿處理組；高劑量組為30μg/mL 介藜蘆堿處理組；與對(duì)照組比較，aP＜0.05

3.3 介藜蘆堿抑制胃癌細(xì)胞EMT 過(guò)程 細(xì)胞免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，介藜蘆堿低、高劑量組胃癌細(xì)胞NCI-N87 中E-cadherin 表達(dá)水平顯著升高（見(jiàn)圖3A）。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，低、高劑量介藜蘆堿促進(jìn)胃癌細(xì)胞NCI-N87 E-cadherin 蛋白表達(dá)，降低Vimentin、ZO-1 蛋白表達(dá)水平（見(jiàn)圖3B），灰度統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

圖3 介藜蘆堿對(duì)E-cadherin、Vimentin、ZO-1 表達(dá)的影響

表2 介藜蘆堿對(duì)E-cadherin、Vimentin、ZO-1 蛋白表達(dá)的影響（）

表2 介藜蘆堿對(duì)E-cadherin、Vimentin、ZO-1 蛋白表達(dá)的影響（）

注：對(duì)照組為NCI-N87 細(xì)胞未經(jīng)處理；低劑量組為10μg/mL 介藜蘆堿處理組；高劑量組為30μg/mL 介藜蘆堿處理組；與對(duì)照組比較，aP＜0.05

3.4 介藜蘆堿調(diào)控胃癌細(xì)胞miR-132-3p/FOXN3軸 與對(duì)照組比較，介藜蘆堿低、高劑量組胃癌細(xì)胞miR-132-3p 表達(dá)明顯降低，其靶基因FOXN3 表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 介藜蘆堿對(duì)胃癌細(xì)胞miR-132-3p 和FOXN3 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響（）

表3 介藜蘆堿對(duì)胃癌細(xì)胞miR-132-3p 和FOXN3 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響（）

注：對(duì)照組為NCI-N87 細(xì)胞未經(jīng)處理；低劑量組為10μg/mL 介藜蘆堿處理組；高劑量組為30μg/mL 介藜蘆堿處理組；與對(duì)照組比較，aP＜0.05

4 討論

介藜蘆堿是從藜蘆中分離出的天然甾體生物堿。研究表明，其可以抑制人骨髓增生異常細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，從而減輕骨髓增生異常綜合癥[8]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，介藜蘆堿可以通過(guò)誘導(dǎo)自噬來(lái)抑制人肝細(xì)胞癌的進(jìn)展[9]。

胃癌細(xì)胞惡性增殖以及轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌惡性進(jìn)展的主要原因。本研究首先檢測(cè)了介藜蘆堿對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖影響，利用不同劑量的介藜蘆堿處理胃癌細(xì)胞，對(duì)其細(xì)胞增殖并無(wú)影響。因此，我們進(jìn)一步探討了介藜蘆堿對(duì)胃癌細(xì)胞遷移及侵襲的影響，研究結(jié)果顯示，介藜蘆堿對(duì)胃癌細(xì)胞NCI-N87 的遷移和侵襲有明顯的抑制作用。

EMT 是腫瘤細(xì)胞獲得高轉(zhuǎn)移和侵襲能力的關(guān)鍵過(guò)程[10]。發(fā)生時(shí)E-cadherin 下降，而Vimentin、ZO-1表達(dá)上調(diào)[11]。檢測(cè)介藜蘆堿對(duì)E-cadherin、Vimentin及ZO-1 表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低、高劑量的介藜蘆堿均能夠上調(diào)E-cadherin 表達(dá)、降低Vimentin 與ZO-1 的表達(dá)。提示介藜蘆堿對(duì)胃癌細(xì)胞遷移、侵襲的抑制作用可能是通過(guò)調(diào)控EMT 相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)揮作用的。

胃癌是一種上皮源性腫瘤，主要的轉(zhuǎn)移機(jī)制是EMT 過(guò)程的轉(zhuǎn)變，隨著癌細(xì)胞的不斷增殖，癌灶越來(lái)越大，逐漸侵犯富含淋巴管的黏膜肌層和下層，部分胃癌細(xì)胞脫落原發(fā)灶轉(zhuǎn)移至毛細(xì)淋巴管周圍，與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞緊密黏附，進(jìn)入淋巴管腔，達(dá)到淋巴結(jié)，形成遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[12]。本研究結(jié)果顯示，介藜蘆堿可以明顯抑制胃癌細(xì)胞的EMT 行為，這將極大限制胃癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的可能性。

miRNA 是由21～25 個(gè)核苷酸組成的一類非編碼RNA，參與基因調(diào)控[13]。miRNA 在胃癌的治療、診斷及預(yù)后方面具有重要意義[14-15]。已知miR-132-3p 在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用，并有可能作為早期檢測(cè)腫瘤發(fā)展、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的預(yù)后標(biāo)志物[16]。檢測(cè)介藜蘆堿處理后miR-132-3p 的表達(dá)，結(jié)果顯示，介藜蘆堿可降低miR-132-3p 的表達(dá)而增加其靶基因FOXN3的表達(dá)。因此，介藜蘆堿可能通過(guò)影響miR-132-3p及靶基因FOXN3 的表達(dá)，抑制胃癌EMT 進(jìn)程，降低胃癌的遷移、侵襲能力。