七曜山海拔高度對百合中薯蕷皂苷含量的影響

龔偉，王夢禪*，游靜，陳聯(lián)軍

（1.重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校；2.重慶三峽抗腫瘤天然藥物工程技術(shù)研究中心; 3.重慶安全技術(shù)職業(yè)學(xué)院，4.萬州區(qū)新達(dá)百合種植專業(yè)合作社，重慶萬州 404120）

本品為百合科植物卷丹Lilium lancifolium Thunb、百 合Lilium brownii F.E.Brown var.viridulum Baker或細(xì)葉百合Lilium pumilum DC.干燥肉質(zhì)鱗葉，可食用也可入藥[1]。百合在我國大部分地區(qū)均有分布，其中以江蘇、湖南、重慶、四川、甘肅、陜西等地為主要分布區(qū)域，其中與重慶毗鄰的湖北利川市七曜山區(qū)域也有百合分布[2]。藥用百合含有多種藥效活性成分，主要有多糖、皂苷、生物堿、酚類以及黃酮類化合物等[3-5]。百合中的皂苷是百合的主要生物活性物質(zhì)之一，中醫(yī)認(rèn)為百合性味甘寒，有清心安神、養(yǎng)陰潤肺的功效，常用于治療虛煩驚悸、陰虛久咳、失眠多夢等癥狀。現(xiàn)代研究表明，百合中的皂苷具有一定的抗抑郁[6]和抗腫瘤活性[7]。由于百合中皂苷的藥理作用顯著，故成為中藥百合質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)之一。

據(jù)報(bào)道，百合的不同施肥措施和產(chǎn)地差異對百合中皂苷含量有一定的影響，不同的氣候因素[8]、不同的生長年限[9]、不同品種百合[10]的皂苷含量也有一定的差異，但不同海拔高度對百合中皂苷含量的影響未見系統(tǒng)報(bào)道。百合種植地域分布廣，海拔差異大，本文主要探討三峽中藥材生產(chǎn)區(qū)七曜山區(qū)域百合中皂苷含量隨海拔高度變化的趨勢，為百合適宜栽培區(qū)域的選擇提供科學(xué)依據(jù)。百合中皂苷種類較多，而皂苷類物質(zhì)的檢測常以薯蕷皂苷為檢測指標(biāo)[11-13]，故本實(shí)驗(yàn)主要通過測定薯蕷皂苷的量來反映百合中皂苷的含量情況。

一、材料與儀器

（一）材料

卷丹百合（Lilium lancifolium Thunb.），采自七曜山區(qū)域重慶市萬州區(qū)恒合鄉(xiāng)（H298，H515，H673，H834，H983，H1134）和湖北省利川市謀道鎮(zhèn)（M1246，M1355，M1432）兩個(gè)地區(qū)（數(shù)字為海拔高度），兩地區(qū)相鄰，土壤環(huán)境和氣候條件相似。采摘樣品經(jīng)重慶三峽中藥研究所付紹智教授鑒定，均為卷丹百合。樣品剝?nèi)ト赓|(zhì)鱗葉后，經(jīng)沸水微燙后烘干備用。薯蕷皂苷對照品（中國食品藥品檢定研究院）、甲醇、乙腈為色譜純，乙醇、石油醚、正丁醇為分析純，水為超純水。

（二）儀器

高效液相色譜儀（安捷倫1260），蒸發(fā)光散射檢測器（Agilent 1260 Infinity），GZX-101電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海圣科儀器設(shè)備有限公司），S11-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海博訊），F(xiàn)A1004分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司），RE-25B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海嘉鵬科技有限公司），F(xiàn)E130型粉碎機(jī)，藥典篩。

二、方法

（一）色譜條件

使用Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；以乙腈-0.2%甲酸水溶液（55∶45）為流動(dòng)相；流速為1 mL/min；柱溫為30℃；蒸發(fā)光散色檢測器漂移管溫度為46℃，載氣（N2）流速1.6 L/min，通過對標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的檢測，得到色譜圖見圖1和圖2。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜

圖2 樣品HPLC圖譜

（二）樣品溶液制備[14-15]

樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過40目藥典篩，所得百合粉末在烘箱中經(jīng)50℃烘干至恒重，精密稱定百合粉末30 g至圓底燒瓶，加入80%的乙醇200 mL，在70℃水浴下加熱回流3 h，回流提取2次，合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，并減壓濃縮至干，將濃縮后的干殘?jiān)苡?0 mL水中，再用等體積石油醚萃取3次，棄去石油醚，水層再用等體積水飽和正丁醇萃取4次，合并回收正丁醇，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，濃縮殘?jiān)眠m量甲醇溶解后，移入容量瓶定容至5 mL，作為樣品溶液備用。

（三）對照品溶液制備

精密稱取薯蕷皂苷對照品約10 mg，加甲醇溶解后，移入容量瓶定容至10 mL，制成1.08 mg/mL的對照品溶液。

（四）薯蕷皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密量取薯蕷皂苷對照品各0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL分別置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容到刻度。在上述色譜條件下各進(jìn)樣20μL，測定峰面積值，以峰面積和濃度值進(jìn)行回歸處理，得回歸方程：y=0.173 4x+0.055 8，r=0.999 6。結(jié)果表明，薯蕷皂苷濃度在0.108～0.864 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

（五）精密度實(shí)驗(yàn)

取同一對照品溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每次進(jìn)樣20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定薯蕷皂苷峰面積值，峰面積穩(wěn)定，RSD為1.2%。

（六）穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一樣品溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（產(chǎn)自重慶市萬州區(qū)恒合鄉(xiāng)，批號為H983），每次進(jìn)樣20μL，分別在0，2，4，6，8，12 h各進(jìn)一針，測定皂苷峰面積值，得到的峰面積穩(wěn)定，其RSD為1.5%。

（七）重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號樣品（產(chǎn)自湖北利川謀道鎮(zhèn)，批號為M1355）5份，按（二）樣品溶液制備方法制備供試品溶液，按（一）色譜條件，每次進(jìn)樣20 μL測定皂苷峰面積值，計(jì)算薯蕷皂苷含量為5.4 μg/g，RSD為1.4%。

（八）加樣回收實(shí)驗(yàn)

取薯蕷皂苷含量為5.4 μg/g的藥材粉末（產(chǎn)自湖北利川謀道鎮(zhèn)，批號為M1355）6份，經(jīng)50℃烘干至恒重，各精密稱定約5 g，置具塞錐形瓶中，再加入相當(dāng)于樣品中薯蕷皂苷含量的80%、100% 和120%的薯蕷皂苷對照品溶液，按（二）樣品溶液制備方法制備供試品溶液，分別注入液相色譜儀測定皂苷峰面積值，計(jì)算薯蕷皂苷含量，得到回收率為98.82%，RSD為1.8%。

（九）樣品含量測定

取采集的9個(gè)百合樣品藥材，按照操作制備樣品溶液，在圖1和圖2色譜條件下進(jìn)樣20 μL，測定峰面積并計(jì)算薯蕷皂苷含量，結(jié)果見表1。

表1 百合中薯蕷皂苷含量

由表1可以看出，海拔300 m左右時(shí)薯蕷皂苷含量只有3.85 μg/g，在所有樣品中含量最低，海拔高度升高到500～700 m時(shí)，薯蕷皂苷含量較300 m時(shí)有明顯變化，升高到4.72μg/g，隨著海拔高度的進(jìn)一步升高，到達(dá)到800 m以上時(shí)，薯蕷皂苷含量上升到了5.2 μg/g以上，但在這一階段并不是海拔越高，薯蕷皂苷含量就越高，海拔800～1250 m范圍內(nèi)，薯蕷皂苷的含量并沒有很大的變化，其中海拔1000 m左右時(shí)薯蕷皂苷含量最高，海拔高度上升到1300 m后薯蕷皂苷含量降至5.27 μg/g，1400 m后降至5.21 μg/g。

三、結(jié)果

（一）薯蕷皂苷的提取

旋轉(zhuǎn)了不同比例的乙醇溶液在不同溫度下回流提取百合中的薯蕷皂苷，發(fā)現(xiàn)80%的乙醇提取效果最好，溫度對提取的影響相對較低，70℃溫度不會過高，同時(shí)又能保證乙醇回流速度，縮短提取時(shí)間。

（二）流動(dòng)相的選擇

選擇了乙腈-水（45∶55）、乙腈-水（55∶45）、乙腈-水（65∶35）、乙腈-0.2% 甲酸（45∶55）、乙腈-0.2%甲酸（55∶45）和乙腈-0.2%甲酸（65∶35）6種流動(dòng)相進(jìn)行比較，從整體來看，乙腈-水溶液的洗脫效果不如乙腈-0.2%甲酸溶液，乙腈-0.2% 甲酸溶液中，乙腈-0.2%甲酸（55∶45）流動(dòng)相的洗脫分離效果最好。

（三）ELSD檢測參數(shù)設(shè)定

比較了蒸發(fā)光散色檢測器在不同漂移管溫度和氮?dú)饬髁肯路迕娣e的大小、基線漂移和噪聲情況，發(fā)現(xiàn)在漂移管溫度46℃，載氣（N2）流速1.6 L/min條件下，峰形較好，噪聲較低。

（四）百合中薯蕷皂苷含量測定

在三峽庫區(qū)七曜山區(qū)域，海拔800 m以下時(shí)，卷丹百合中薯蕷皂苷含量隨海拔高度升高而升高，在海拔800～1250 m范圍內(nèi)，薯蕷皂苷含量較高，海拔高度上升到1300 m后薯蕷皂苷含量有下降趨勢，但下降幅度不大。由此可見，海拔800～1250 m范圍適宜卷丹百合總薯蕷皂苷的積累。

四、討論

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，在三峽庫區(qū)七曜山區(qū)域海拔800～1250 m范圍內(nèi)，薯蕷皂苷含量較高，適宜發(fā)展藥食兩用卷丹百合的生產(chǎn)，但由于七曜山區(qū)域海拔高度限制，更高海拔對百合中皂苷含量的影響并未研究。同時(shí)，評價(jià)百合質(zhì)量的指標(biāo)不僅只有皂苷含量，故本項(xiàng)試驗(yàn)對周邊的川渝地區(qū)和鄂西地區(qū)的卷丹百合的基地建設(shè)選址有一定的借鑒意義，但不能憑本指標(biāo)選址。