溫陽消癥方對5/6腎切除小鼠腎纖維化的保護作用及對TGF-β1/Smad3信號通路的影響

林曉蒙 蔡旭東 鐘光輝 余柯娜 伍云洲 何立群

1.浙江中醫藥大學附屬寧波中醫院 寧波 315000 2.上海中醫藥大學附屬曙光醫院

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）是指由各種原因引起的慢性腎臟結構和功能異常，影響到全球9.1%的人口，中國有約1.32億例CKD患者，每年有數百萬患者死于CKD進展后的終末期腎臟病（end stage renal disease，ESRD）[1]。 腎纖維化是CKD進展的病理基礎及最終結局，包括腎小球硬化、腎小管間質纖維化以及動脈硬化和血管周圍纖維化[2]，與腎功能損害的嚴重程度及預后有密切聯系[3]。

轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是最主要的促纖維化因子之一，TGF-β1/Smad3信號通路在腎纖維化過程中發揮了重要作用[4-5]。細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的異常沉積是腎纖維化的主要病理改變。α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA） 和纖維連接蛋白（fibronectin，FN）是ECM的主要成分，也是促進ECM異常沉積的因素。

目前尚未開發出針對腎纖維化的靶點治療藥物，臨床治療主要采用腎素-血管緊張素系統抑制劑，但療效有限，而且由于可影響腎小球濾過率，或導致高鉀血癥等原因，導致臨床應用受到一定限制，故能實際應用于臨床的藥物仍亟待開發。中醫藥在腎纖維化治療方面有良好療效，且中藥的多靶點性、經濟性、安全性已逐漸受到重視。

溫陽消癥方是浙江中醫藥大學附屬寧波中醫院國家級名老中醫張沛虬老先生治療CKD的經驗方，臨床應用證實療效良好，可降低CKD患者的尿蛋白，改善腎功能，減輕臨床癥狀[6]。既往動物實驗證實，該方可改善單側輸尿管梗阻小鼠的腎功能，抑制Ⅰ/Ⅲ型膠原的表達[7-8]。

本研究擬通過建立5/6腎切除小鼠模型，觀察溫陽消癥方對小鼠腎纖維化的保護作用，以及對TGF-β1/Smad3信號通路和α-SMA、FN的影響，進而探討溫陽消癥方抑制腎纖維化可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級C57BL/6小鼠40只，6～8周齡，體質量16～18 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司[實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005]，飼養于上海中醫藥大學動物房[實驗動物使用許可證號：SYXK（滬）2020-0009]。所有小鼠以標準飼料及水適應性喂養1周。本研究已通過上海中醫藥大學動物倫理委員會批準（倫理審批號：PZSHUTCM210507018）。

1.2 藥物 溫陽消癥方（組成：黃芪30 g，黨參30 g，仙靈脾15 g，肉蓯蓉15 g，桃仁12 g，川芎15 g，莪術30 g）由浙江中醫藥大學附屬寧波中醫院中藥房提供。纈沙坦膠囊（規格：80 mg×7粒）購于諾華制藥有限公司（國藥準字：H20040217）。

1.3 主要試劑與儀器 血清肌酐試劑盒、尿素氮試劑盒均購于寧波美康生物科技股份有限公司（批號：210403101、210421201）；蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色試劑盒、Masson染色試劑盒均購于北京索萊寶科技有限公司（批號：G1121、G1345）；通用反轉錄試劑盒、總RNA抽提試劑盒、ComSYBR qPCR Mix（with ROX）試劑均購于上海諾倫生物醫藥技術有限公司（批號：LR-0103B、LN-0108B、LK-0107BB）；HRP標記的山羊抗兔IgG抗體及山羊抗小鼠IgG抗體均購于上海翌圣生物科技股份有限公司（批號：33106ES60、33206ES60）；TGF-β1抗體、Smad3抗體、α-SMA抗體、FN抗體均購于Jakeson公司（批號：ab92486、ab40854、ab32575、sc-81767）。 MX3000P型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，Realtime qPCR）儀購于德國Agilent公司；VE-180型垂直電泳槽購于天能公司；DY-B1型脫色搖床購于上海青浦滬西儀器廠；KODAK X-Omat BT Film、X光片顯影液及定影液均購于Kodak公司。

1.4 5/6腎切除小鼠模型的建立和干預

1.4.1 分組與建模 C57BL/6小鼠中隨機選取10只作為假手術組，其余按照文獻[9]描述的方法制作5/6腎切除模型。手術分兩期，一期切除左腎2/3腎組織，使用異氟烷麻醉機，以5%異氟烷誘導麻醉，2～3 min后確認小鼠已完全麻醉，置于恒溫加熱墊，麻醉面罩對準口鼻，調節氧流量維持麻醉（異氟烷濃度1.0%～1.5%），仰臥位暴露左側胸腹部并清除毛發，碘伏消毒后于左肋下1 cm處，45°斜向外下方切開1 cm，取出左腎，分離腎周脂肪及包膜，切除腎臟上下極組織（上下各1/3），并立即用明膠海綿壓迫止血10 min，確定無活動性出血后將左腎復位，逐層關閉并縫合。7 d后行二期手術，按上法麻醉，取出并暴露右腎，將右腎蒂結扎，切除右腎，并縫合。兩期手術共切除5/6的腎臟。假手術組麻醉后僅暴露雙側腎臟，分離腎周脂肪、包膜后縫合肌肉及皮膚。

術后14 d，內眥采血測定血清肌酐水平，共30只小鼠確定造模成功，將造模的30只小鼠隨機分為模型組、纈沙坦組、溫陽消癥組，每組各10只。

1.4.2 給藥 術后14 d，假手術組及模型組每日以0.9%氯化鈉注射液0.2 mL灌胃；溫陽消癥組每日予溫陽消癥方水煎劑0.2 mL灌胃，人鼠藥物劑量按20倍換算[10]，小鼠給藥劑量為49 g/（kg·d）；纈沙坦組每日予纈沙坦膠囊水懸液0.2 mL灌胃，人鼠藥物劑量按12.33倍換算[11]，小鼠給藥劑量16.5 mg/（kg·d）。各組灌胃均持續8周。

1.4.3 取材 給藥療程結束后，各組小鼠予10%水合氯醛（0.6 mL/100g）麻醉后眼眶采血，靜置后2 000 r/min離心10 min，分離血清，檢測血清肌酐、尿素氮水平。采血后頸椎脫臼處死小鼠，留取腎組織，一半置于4%多聚甲醛溶液中固定，以備染色觀察；另一半液氮速凍后-80℃保存，以備mRNA及蛋白表達檢測。

1.5 指標檢測

1.5.1 生化指標檢測 血清肌酐、尿素氮的檢測根據試劑盒說明書操作。

1.5.2 腎組織病理學觀察

1.5.2.1 HE染色 取出4%多聚甲醛溶液固定的腎組織，脫水，石蠟包埋、切片后進行染色，400倍光鏡下觀察腎小球、腎小管上皮細胞，間質炎癥細胞浸潤及纖維化情況。

1.5.2.2 Masson染色 分別以Weigert鐵蘇木素、麗春紅酸性品紅染液、磷鉬酸溶液、苯胺藍染液等處理切片，光鏡下觀察腎間質藍染區域，每只小鼠制作5張切片，400倍光鏡下每張切片隨機選取5個不重疊視野（排除腎小球部分），使用Image-Pro plus 6.0軟件分析膠原染色陽性率，然后取平均值。

1.5.3 Real-time qPCR檢測腎組織α-SMA、FN、TGF-β1、Smad3 mRNA的表達 提取總RNA后行逆轉錄反應，逆轉錄體系包括：總RNA 5 μL、2×逆轉錄緩沖液10 μL、逆轉錄引物1.2 μL、Money鼠白血病病毒（Money murine leukemia virus，MMLV） 逆轉錄酶0.2 μL，并以焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）水加至20 μL；反應條件：30 ℃ 30 min，42 ℃ 30min，85℃ 10 min。PCR反應體系包括：2×Master Mix 10 μL、上下游引物0.08 μL、cDNA模板2 μL、Taq DNA聚合酶0.2 μL，用dd H2O加至20 μL；反應條件：變性95 ℃ 3 min，95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 s，共40個循環。讀取循環閾值（cycle threshold，CT）值并計算2-△△CT值，表示mRNA相對表達量。PCR引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5.4 免疫印跡法檢測腎組織α-SMA、FN、TGF-β1、Smad3蛋白的表達 組織細胞樣本裂解后，提取總蛋白并進行蛋白定量，取10 μL行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳，完成電泳后，4℃轉膜封閉過夜，洗滌后加入一抗（稀釋比例分別為α-SMA 1∶1 000，FN 1∶100，TGF-β11∶300，Smad3 1∶1 000）37 ℃溫育2 h，再次洗滌后加入二抗（稀釋比例為1∶2 000）37 ℃溫育2 h，洗滌后化學發光檢測，顯影定影后以凝膠成像分析系統拍照，使用Gel-Pro Analyzer軟件進行分析處理。

1.6 統計學分析 應用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以±s表示，兩組間比較使用獨立樣本t檢驗，多組間比較使用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠生化指標比較 造模術后第14天，造模組小鼠血肌酐（18.67±1.92）μmol·L-1較假手術組（9.60±1.90）μmol·L-1顯著升高（P＜0.01），提示造模成功。給藥8周后，溫陽消癥組和纈沙坦組的小鼠血肌酐、尿素氮均較模型組顯著降低（P＜0.01），溫陽消癥組與纈沙坦組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠腎功能指標比較Tab.2 Comparison of renal function indexes in each group（±s）

表2 各組小鼠腎功能指標比較Tab.2 Comparison of renal function indexes in each group（±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，ΔΔP＜0.01。Note:Compared with sham operation group，**P＜0.01;compared with model group，ΔΔP＜0.01.

組別 n 肌酐（μmol·L-1） 尿素氮（mmol·L-1）假手術組 10 9.70±3.13 15.76±1.41模型組 10 21.90±4.18** 27.00±1.90**纈沙坦組 10 17.60±2.50ΔΔ 22.71±2.10ΔΔ溫陽消癥組 10 15.80±1.87ΔΔ 22.39±1.68ΔΔ

2.2 各組小鼠腎組織病理改變比較 HE染色提示，假手術組腎小球結構完整，毛細血管襻開放良好，小管間質無炎癥細胞浸潤；模型組可見腎小球硬化，系膜細胞及基質增生，腎小管萎縮，小管上皮細胞脫落、空泡變性，腎小管管腔擴張，腎間質炎性細胞浸潤；溫陽消癥組及纈沙坦組上述病理改變較模型組輕微。Masson染色提示，模型組腎間質明顯藍染區域增多，與假手術組比較，模型組膠原染色陽性率顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，溫陽消癥組與纈沙坦組膠原染色陽性率顯著降低（P＜0.01）；與纈沙坦組比較，溫陽消癥組膠原染色陽性率降低（P＜0.05）。見圖1～3。

圖1 各組小鼠腎組織病理改變（HE染色，400×）Fig.1 Renal histopathological changes in each group （HE staining， 400×）

圖2 各組小鼠腎組織膠原染色（Masson染色，400×）Fig.2 Collagen staining of renal tissue in each group（Masson staining， 400×）

圖3 各組膠原染色陽性率比較Fig.3 Comparison of collagen staining positive rates in each group

2.3 各組小鼠腎組織α-SMA、FN mRNA和蛋白表達比較 與假手術組比較，模型組α-SMA、FN mRNA和蛋白表達均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，溫陽消癥組和纈沙坦組α-SMA、FN mRNA和蛋白表達均顯著降低（P＜0.01）；與纈沙坦組比較，溫陽消癥組α-SMA mRNA和蛋白表達均顯著降低（P＜0.01），FN的mRNA表達降低（P＜0.05）。 見圖4、5。

圖4 各組小鼠腎組織α-SMA、FN mRNA表達比較Fig.4 Comparison of α-SMA and FN mRNA expression of renal tissue in each group

圖5 各組小鼠腎組織α-SMA、FN蛋白表達比較Fig.5 Comparison of α-SMA and FN protein expression of renal tissue in each group

2.4 各組小鼠腎組織TGF-β1、Smad3 mRNA和蛋白表達比較 與假手術組比較，模型組TGF-β1、Smad3 mRNA和蛋白表達均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，溫陽消癥組及纈沙坦組TGF-β1mRNA和蛋白表達 、Smad3蛋白表達均顯著降低（P＜0.01），Smad3 mRNA表達均降低 （P＜0.01，P＜0.05）；與纈沙坦組比較，溫陽消癥組TGF-β1mRNA的表達顯著降低（P＜0.01）。 見圖6、7。

圖6 各組小鼠腎組織TGF-β1、Smad3 mRNA表達比較Fig.6 Comparison of TGF-β1and Smad3 mRNA expression of renal tissue in each group

圖7 各組小鼠腎組織TGF-β1、Smad3蛋白表達比較Fig.7 Comparison of TGF-β1and Smad3 protein expression of renal tissue in each group

3 討論

腎纖維化是有多種因素共同參與的進展性過程，炎癥、缺氧、高血糖、蛋白尿等一種或多種致病因素引起腎臟固有細胞損傷，大量炎性因子活化釋放，炎癥細胞浸潤，促纖維化因子和抗纖維化因子失調，肌成纖維細胞激活，導致ECM合成和分解失衡，ECM大量沉積，最終形成纖維化瘢痕組織，在這一過程中，中心環節即為肌成纖維細胞的激活和ECM合成降解失調[12-13]。

腎纖維化尚無特效藥物，目前臨床療效較為確切的首選藥物為血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（angiotensin Ⅱ receptor antagonist，ARB），其可阻斷血管緊張素Ⅱ對TGF-β1的過度活化作用，從而改善腎纖維化，故本研究選取ARB纈沙坦作為陽性對照藥物。

傳統醫學中并無“CKD、腎纖維化”之名，相關內容多見于“溺毒、關格、水腫、血尿、虛勞、尿濁”等疾病中。國家級名中醫王永鈞教授[14]提出腎纖維化是“腎內微型癥積”的學說，從中醫角度認為腎纖維化是病邪侵入腎絡，瘀毒痰濕等病理產物久積腎絡，導致腎絡瘀阻，最終引起微型癥積的過程，這與西醫損傷因子導致成纖維細胞增生-微循環持續受損-腎纖維化形成的過程極其相似[15]，張沛虬老先生的溫陽消癥方也契合了這一理論。從“腎內微型癥積”的理論聯系腎纖維化的發病機制，陽虛血瘀是其重要病機。腎病之人，常有先天不足，后天失養，脾腎陽虛，久病則脈絡瘀阻，《素問·調經論》中指出：“氣血者，喜溫而惡寒，寒則泣而不行，溫則消而去之。”血為陰，得陽則運，若陽虛火衰，則血失其運，凝于脈中，結為瘀滯，可見陽虛與血瘀之間有密不可分的關系。溫陽消癥方益氣溫陽、活血消癥，方中黃芪為補氣要藥，與黨參共用，加強健脾益氣之功，使后天脾胃之本化生有源。腎主一生之陰陽，腎陽為“諸陽之本”，促進人體生理機能的運行，仙靈脾、肉蓯蓉溫補腎陽，促進先天之陽與脾胃之陽互生互通。桃仁、莪術、川芎均可活血化瘀，而莪術重在消癥理氣，川芎行氣祛風，三者共用，可改善腎內微型癥積。諸藥合用，共奏扶正化瘀、延緩纖維化之效。

研究證實，溫陽消癥方中多種成分具有抗腎纖維化的作用。黃芪是中醫腎病學中研究最廣泛的藥物之一，其主要有效成分黃芪甲苷，可減輕5/6腎切除腎衰大鼠腎功能及腎臟病理損傷[16]；在糖尿病腎病小鼠模型中，黃芪甲苷可減少TGF-β1的表達，抑制TGF-β1/smad信號通路，延緩腎纖維化進展[17]。淫羊藿總黃酮減少糖尿病大鼠TGF-β1的表達，緩解腎損傷[18]。桃仁可上調單側輸尿管梗阻 （unilateral ureteral occlusion，UUO）大鼠上皮細胞鈣黏蛋白、α-SMA的表達，下調FN表達，從而抑制腎小管上皮細胞轉分化，減緩腎纖維化進程[19]。川芎的有效成分川芎嗪可下調UUO大鼠腎組織中TGF-β1水平，同時上調Smad逆向調控因子Smad7和轉錄共抑制因子（ski-related novel protein N，SnoN）蛋白表達水平，從而減輕腎纖維化[20]。

本研究結果顯示，術后第14天，造模組小鼠血肌酐水平較假手術組顯著升高，提示造模成功。給藥8周后，兩個治療組小鼠血肌酐、尿素氮水平較模型組顯著降低，與纈沙坦組比較，溫陽消癥組肌酐、尿素氮水平差異雖無統計學意義，但呈降低趨勢。病理形態學觀察提示，兩個治療組的腎小球、腎小管損傷程度，以及溫陽消癥組的間質損傷程度較模型組減輕，膠原染色陽性率顯著低于模型組，而且溫陽消癥組優于纈沙坦組。此結果提示，溫陽消癥方對腎纖維化小鼠的腎功能及病理形態改變有改善作用。

腎纖維化的嚴重程度與肌成纖維細胞數量呈正相關，α-SMA是肌成纖維細胞獨特的標記蛋白，可以使后者收縮遷移能力顯著增加，并大量分泌ECM[21]。FN是ECM的關鍵成分，生理情況下，FN維持細胞的正常形態，參與細胞之間、細胞與基質之間的連接；病理狀態下，FN可作為其他ECM成分之間的支架，促進ECM聚集，并對炎癥細胞有趨化作用[22]。本研究結果顯示，溫陽消癥組及纈沙坦組的小鼠α-SMA及FN mRNA和蛋白表達均顯著低于模型組；與纈沙坦組比較，溫陽消癥組α-SMA mRNA和蛋白的表達均顯著下降，FN的mRNA表達降低，提示溫陽消癥方可顯著下調腎纖維化關鍵指標α-SMA及FN的表達，減少ECM沉積。

TGF-β1是腎纖維化的中樞介質，可誘導間質成纖維細胞活化成為表達α-SMA的肌成纖維細胞，促進ECM的合成。Smad信號系統在調節TGF-β1中起核心作用，在腎纖維化和炎癥的情況下，Smad3發揮促纖維化作用[23-24]。研究發現，中藥復方或中藥有效成分能夠通過TGF-β1/Smad3通路改善腎纖維化[25-30]。本研究結果顯示，溫陽消癥組和纈沙坦組TGF-β1mRNA和蛋白表達及Smad3蛋白的表達均顯著低于模型組，Smad3 mRNA的表達低于模型組；與纈沙坦組比較，溫陽消癥組TGF-β1mRNA的表達顯著下降。可見溫陽消癥方能夠下調TGF-β1、Smad3的表達，提示其減輕腎纖維化的機制可能與調控抑制TGF-β1/Smad3信號通路有關。

綜上所述，溫陽消癥方可改善5/6腎切除小鼠腎功能，減輕病理形態改變，下調腎纖維化標志物α-SMA及FN的蛋白和mRNA表達，減輕ECM異常沉積，其機制可能與抑制了TGF-β1/Smad3信號通路有關。本研究為中醫藥治療腎纖維化提供了新的證據，但仍然存在以下不足：首先，溫陽消癥方的具體有效成分尚不明確，仍需進一步研究，如以高效液相色譜法分析中藥復方有效成分；其次，本研究的機制研究不夠深入，未來可從分子生物學的角度進一步深入研究。