慢性不可預知溫和應激通過抑制JAK2-PI3K通路影響乳腺癌小鼠胸腺功能的實驗研究

郭文琴 許勰 劉曦 高建莉

1.浙江中醫藥大學藥學院 杭州 310053 2.浙江中醫藥大學基礎醫學院

乳腺癌是中青年女性高發疾病之一，其發病率呈逐年上升趨勢，雖然其病因尚未完全闡明，但既往研究表明，抑郁障礙等不良負性情緒與乳腺癌的發生、發展及預后密切相關[1-4]。2017年美國整合腫瘤學會（Society for Integrative Oncology，SIO）臨床實踐指南指出，乳腺癌患者伴發抑郁的比例為3%～34%，伴發焦慮的比例12%～47%，11%～16%的患者同時伴有焦慮和抑郁癥狀[5]。研究發現，抑郁癥會進一步促使腫瘤惡化，極大降低患者治療的依從性，并影響治療效果[6]。然而，情志失調是如何促進乳腺癌的發生發展的，目前尚缺乏可靠的科學依據。

胸腺作為機體的中樞免疫器官，在維持機體正常的免疫功能中發揮重要作用。同時，人體免疫系統與中樞神經系統具有密切聯系，情緒障礙和應激事件可以影響免疫功能，而免疫功能的改變也可能成為抑郁障礙的病因[7-12]。有研究表明，抑郁障礙患者體內調節性T細胞數量明顯下降[13]。但情志失調對乳腺癌機體胸腺的發育及其功能的影響以及具體機制如何，尚無系統研究。

前期研究發現，胸腺基質淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP），作為一種白細胞介素-7（interleukin-7，IL-7）樣細胞因子，在乳腺癌機體中表達增加，通過激活其下游的TSLP因子相關通路，促進腫瘤細胞的存活[14-15]。此外，抑郁癥患者體內IL-7水平降低，與抑郁程度呈負相關[16]。以上結果提示，TSLP及IL-7的表達以及下游通路的激活情況，可能是研究情志失調狀態下的乳腺癌機體免疫功能的關鍵。

為此，本研究采用慢性不可預知溫和應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）刺激乳腺癌小鼠，對其胸腺形態、病理變化、功能變化及相關因子和蛋白的表達進行系統的研究，以期探明情志內傷時乳腺癌小鼠胸腺功能的變化及其對乳腺癌發展的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及細胞株 小鼠乳腺癌細胞株4T1由美國芝加哥大學何通川教授惠贈。5周齡無特殊病原體（specific pathogen free，SPF）級雌性BALB/c小鼠，共30只，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司[實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005]，飼養于浙江中醫藥大學實驗動物中心全封閉SPF環境中[實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2021-0012]，室溫25℃，相對濕度40%～60%，每日光照12 h，自由攝食和飲水。本研究經過浙江中醫藥大學動物倫理審查（批準編號：IACUC-20210517-07）。

1.2 主要試劑 達爾伯克改良伊格爾高糖培養基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM） 購于美國Gibco公司（批號：8121525）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 購于天杭生物公司 （批號：19110503）；DNA提取酚試劑購于北京索萊寶科技有限公司（批號：1026Y011）；哺乳動物基因組DNA提取試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒、含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色液的防熒光淬滅劑均購于碧云天生物技術研究所（批號：081020210105、082720201230、121720201228、041 221211026）；血清素/5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購于生工（上海）生物工程股份有限公司（批號：H129AD0273）；Rabbit anti-mouse CD3、Rabbit anti-mouse CD4、Rabbit anti-mouse CD8a抗體均購于BD Pharmingen公司（批號：1025233、0231898、3276860）；Rat anti-Mouse CK5抗體購于Affinity Biosciences公司（批號：57u2005）；Rabbit anti-Mouse CK8、TSLP，Goat anti-Rabbit IgG抗體均購于Abcam公司（批號：GR3181962-4、GR3728 1-1、GR3299244-3）； 異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate isomer，FITC）標記的Mouse anti-Rabbit IgG、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、磷酸化信號轉導和轉錄激活因子3（phospho-signal transducer and activator of transcription 3，p-STAT3） 抗體均購于Santa Cruz公司（批號：K2017、D3015、A0521、A0723）；Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2） 抗體、 磷酸化Janus激酶2（phospho-Janus kinase 2，p-JAK2）抗體、磷脂酰肌醇-3-激酶p110α （phosphatidylinositol-3-kinase p110α，PI3K p110α）抗體、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶p85/p55（phospho-phosphatidylinositol-3-kinase p85/p55，p-PI3K p85/p55）抗體均購于Cell Signaling Technology公司（批號：13、3、9、6）；F（ab’） 2-Goat Anti-Mouse IgG（H+L）Alexa Fluor 594購于達文生物有限公司（批號：GAR48810900223）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養 4T1細胞采用含10%FBS的DMEM完全培養基，置于5% CO2、37℃培養箱中培養，每2～3 d傳代。

1.3.2 CUMS乳腺癌小鼠模型建立 選取健康BALB/c小鼠30只，隨機分為正常組、模型組、CUMS-1組、CUMS-2組及CUMS-3組，每組6只。除模型組及正常組外， 每只小鼠每日施以CUMS：（1）夾尾3 min；（2）160 次/min水平搖晃5 min；（3）圓筒束縛3 h：將小鼠放入固定器中，限制小鼠活動，使其不能前進、后退及轉身，每天夜間進行束縛；（4）傾斜鼠籠1 h。每次采用1種刺激，每日分別刺激1（CUMS-1組）、3（CUMS-2組）、5（CUMS-3組）次，隨機安排，使小鼠不能預知下次的刺激，以避免產生適應，共刺激30 d。CUMS刺激5 d后，除正常組外，每只小鼠均于右側第二對乳腺脂肪墊下接種1×107/mL 4T1細胞懸液100 μL，制備小鼠4T1乳腺癌荷瘤抑郁模型。造模48 h后，觀察到接種部位有點狀凸起，即為造模成功。

1.3.3 模型小鼠行為指標檢測

1.3.3.1 一般狀況觀察 于模型建立前、模型建立后10、20及30 d分別觀察各組小鼠外觀體征、行為活動。

1.3.3.2 曠場實驗（open field test，OFT） 模型建立后，用OFT法進行測試。自制方形敞箱，箱底面積為50 cm×50 cm，等分為25格，箱高50 cm。記錄小鼠在中央區域（中間9格）及邊緣區域（中央區域外周的16格）的停留時間。從小鼠4爪均進入方格開始計算，每次測定小鼠3 min內的運動情況。

1.3.3.3 強迫游泳實驗（forced swimming test，FST）正式實驗前1 d先行預實驗訓練游泳，將小鼠置于高約30 cm，直徑20 cm的透明玻璃圓桶中，水深15 cm，水溫（25±5）℃，確保小鼠不能跳出水槽或觸及底部。正式實驗時以攝像機記錄小鼠6 min內的游泳過程，并對最后4 min內的不動（漂浮以及上身不動，下肢踩水算作不動）時間進行統計。

1.3.4 小鼠體質量和腫瘤體積的測量 每5 d稱量小鼠體質量1次，觀察并記錄給藥后小鼠體質量變化。用游標卡尺測量瘤體長徑（length，L）和短徑（width，W），單位均為mm，根據公式計算腫瘤體積（volume，V）（mm3）：V=（L+W）×L×W×0.2618。

1.3.5 小鼠腫瘤質量及各臟器指數的檢測 眼球取血后脫頸椎處死小鼠，剖取瘤體、胸腺、肺臟、肝臟，稱量質量后拍照，計算臟器指數和肺轉移率。按下列公式計算：臟器指數（%）=臟器質量（g）/體質量（g）×100%。

1.3.6 ELISA檢測5-HT水平 小鼠眼球取血后斷頭處死，取小鼠大腦組織0.2 g，置于0.9%氯化鈉溶液中冰浴勻漿，離心取上清液，依照試劑盒說明書檢測5-HT水平。

1.3.7 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-time quantitative polymerase chain reaction， Real-time qPCR）檢測外周血單個核細胞基因組DNA中T細胞受體重排刪除環（T cell receptor rearrangement excision circles，TRECs）的表達 小鼠取新鮮抗凝血，裂解紅細胞后離心收集細胞沉淀。按哺乳動物基因組DNA提取試劑盒說明書提取小鼠外周血單個核細胞DNA。反應體系共20 μL，包括 2×SG Fast qPCR 10 μL，10 μmol·L-1的上下游引物各0.4μL，PCR-grade water 8.2 μL，Template cDNA 1 μL。 混勻后離心5 s，使用熒光定量PCR儀進行PCR反應。反應條件為：94℃，4 min；94 ℃，30 s；57 ℃，30 s；72 ℃，31 s，共40個循環。引物均由生工（上海）生物工程股份有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3.8 Real-time qPCR檢測胸腺中TSLP、STAT3、IL-1α、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-17、 叉頭樣轉錄因子p3（forkhead transcription factor p3，Foxp3）、 轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）mRNA表達 以組織RNA快速提取試劑盒提取胸腺RNA，按照cDNA逆轉錄試劑盒說明書，將RNA逆轉錄為cDNA。 反應體系共20 μL， 包括2×SG Fast qPCR 10 μL，10 μmol·L-1的上下游引 物各0.4 μL，PCR-grade water 8.2 μL，Template cDNA 1 μL。 混勻后離心5 s，使用熒光定量PCR儀進行PCR反應。反應條件為：94 ℃，4 min；94 ℃，30 s；57 ℃，30 s；72 ℃，31 s，共40個循環。引物均由生工（上海）生物工程股份有限公司合成，序列見表1。

1.3.9 免疫熒光法檢測胸腺上皮細胞（thymus epithelial cells，TECs）分布 胸腺組織以4%中性甲醛固定48 h后，脫水，透明，浸蠟，包埋，行5 μm切片。 切片脫臘水化后，進行微波修復，0.3% H2O2室溫孵育15 min，加入一抗后4℃孵育過夜；洗滌后加入熒光標記的二抗，室溫避光孵育2 h；用含DAPI染色液的防熒光淬滅劑封片，以VS120-S6-W數字病理切片（熒光）掃描分析儀觀察。

1.3.10 流式細胞術分析胸腺T細胞亞群 完整分離小鼠胸腺，用注射器的無菌活塞研磨胸腺組織，取胸腺細胞制成單細胞懸液，1 500 r·min-1低速離心5 min，去掉上清液，重懸細胞并洗滌1次，4℃下以1%牛血清蛋白（bovine albumin， BSA）封閉20 min。 加入CD3、CD4、CD8抗體， 冰上避光孵育30 min。 以BD C6流式細胞儀采集數據，并使用FCS Express V3進行分析，Image J軟件分析熒光強度。

1.3.11 免疫印跡法檢測TSLP、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、PI3K、p-PI3K蛋白表達 將小鼠胸腺完整取出，勻漿提取總蛋白，以蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度（實驗方法參照試劑盒說明書）。通過電泳分離，將蛋白轉移至活化的聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上，隨后封閉，加入一抗4℃孵育過夜；洗膜3次后加入二抗，室溫避光孵60 min。 化學發光（efficient chemiluminescence，ECL）試劑盒顯色，利用Image J軟件定量分析蛋白灰度值，以GAPDH為內參，計算蛋白相對表達量。

1.4 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件軟件進行統計學分析。計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。符合正態分布的計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗；不符合正態分布的組間比較采用非參數檢驗分析，組內比較用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。OFT及FST視頻以Smart 3.0軟件進行分析。

2 結果

2.1 小鼠一般狀況觀察 造模30 d后，正常組及模型組小鼠毛色光亮，身形健碩，活動靈敏，自主活動能力良好，自主活動多；CUMS-1組及CUMS-2組小鼠毛色較粗糙，身形略消瘦，活動略遲鈍，自主活動能力變差；CUMS-3組小鼠毛色粗糙，身形極消瘦，活動遲鈍，自主活動能力差。

2.2 各組小鼠OFT比較 與正常組比較，模型組、CUMS-1組及CUMS-3組小鼠的中央區域停留時間均略有減少；CUMS-2組停留時間延長，但差異無統計學意義（P＞0.05）。 見圖1。

圖1 各組小鼠運動軌跡Fig.1 Movement trajectory of each group

2.3 各組小鼠FST比較 與正常組小鼠的不動時間（80.07±46.63）s比較，模型組不動時間增加至（132.52±49.78） s、CUMS-1組增至（163.51±18.81） s，CUMS-3組增至（141.65±16.51） s，但差異均無統計學意義（P＞0.05），CUMS-2組小鼠不動時間與正常組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4 各組小鼠體質量和腫瘤體積比較 正常組與模型組小鼠體質量隨飼養天數增加而增加，兩組間體質量差異無統計學意義（P＞0.05）。與正常組比較，造模第1～15天內CUMS-1、CUMS-2和CUMS-3組小鼠體質量均顯著降低，造模第15天時降到最低，CUMS-2組下降最為明顯（P＜0.01），CUMS-3組次之（P＜0.001），CUMS-1組下降幅度最小（P＜0.01）。造模15 d后，各組體質量逐漸升高。見圖2。

圖2 各組小鼠體質量、腫瘤體積比較Fig.2 Comparison of body weight and tumor volume in each group

此外，模型組及CUMS各組小鼠腫瘤體積均隨實驗天數增加而增加。與模型組比較，CUMS各組腫瘤體積均降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）。CUMS-1組小鼠腫瘤體積最大，CUMS-3組次之，CUMS-2組最小，但組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

2.5 各組小鼠腫瘤質量及各臟器指數比較 與正常組比較，模型組及CUMS-1、CUMS-2和CUMS-3組小鼠脾臟指數升高（P＜0.01，P＜0.0001，P＜0.01，P＜0.0001）。各組胸腺質量及指數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，CUMS-1和CUMS-3組小鼠腫瘤質量無明顯變化，腫瘤指數升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）。各荷瘤組腫瘤肺轉移率均達到100%。與模型組比較，CUMS-3組小鼠乳腺癌肺轉移灶總數由（12.13±3.06）個增加至（16.86±4.46）個。見表2、圖3。

表2 各組小鼠臟器指數Tab.2 Mice organ index in each group （±s， n=6）

表2 各組小鼠臟器指數Tab.2 Mice organ index in each group （±s， n=6）

注：與正常組比較，##P＜0.01，####P＜0.0001。Note:Compared with normal group，###P＜0.001，####P＜0.0001.

組別 腫瘤質量（g） 腫瘤指數（%） 脾臟指數（%） 胸腺質量（g） 胸腺指數（%）正常組 - - 0.45±0.04 0.05±0.02 0.26±0.10模型組 0.47±0.20 2.45±1.01 1.49±0.50## 0.04±0.01 0.22±0.03 CUMS-1 組 0.64±0.25 3.74±1.64 2.04±0.39#### 0.04±0.01 0.27±0.04 CUMS-2 組 0.28±0.07 1.59±0.30 0.99±0.22## 0.05±0.01 0.26±0.05 CUMS-3 組 0.60±0.15 3.45±0.94 1.52±0.14#### 0.04±0.01 0.25±0.03

圖3 各組小鼠代表性臟器Fig.3 The representative organs in each group

2.6 各組小鼠大腦組織5-HT水平比較 與正常組比較，模型組小鼠大腦組織5-HT水平無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，CUMS-1組及CUMS-2組小鼠5-HT水平無明顯變化，差異均無統計學意義（P＞0.05），CUMS-3組小鼠5-HT水平顯著降低（P＜0.01），提示每日5次刺激使荷瘤小鼠5-HT水平紊亂。見圖4。

圖4 各組小鼠大腦組織5-HT水平比較Fig.4 Comparison of 5-HT levels in brain tissue in each group

2.7 各組小鼠外周血單個核細胞基因組DNA中TRECs表達比較 與正常組比較，模型組外周血中TRECs表達顯著升高（P＜0.01）； 與模型組比較，CUMS-3組小鼠外周血中TRECs表達明顯降低（P＜0.01），提示接受刺激的荷瘤小鼠近期胸腺輸出功能顯著降低。見圖5。

圖5 各組小鼠外周血單個核細胞基因組DNA中TRECs表達比較Fig.5 Comparison of TRECs expression in genomic DNA of peripheral blood mononuclear cells in each group

2.8 各組小鼠胸腺TSLP、Foxp3、IL-7、IL-1α、IL-12、IL-17、STAT3、TGF-β1和TNF-α等mRNA水平比較與正常組比較，模型組小鼠胸腺中IL-7 mRNA水平顯著降低（P＜0.001）， 而TSLP、Foxp3、IL-1α、IL-12、IL-5、IL-6、IL-10、STAT3、TGF-β1和TNF-α均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001，P＜0.0001）。 與模型組比較，CUMS-3組小鼠胸腺中TSLP及IL-7 mRNA水平均顯著升高 （P＜0.001）， 而Foxp3、IL-1α、IL-12、IL-6、IL-5、IL-10、IL-17、STAT3、TGF-β1和TNF-α水平均顯著降低（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.0001）。 見圖6。

圖6 各組小鼠胸腺中 TSLP、Foxp3、IL-1α、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-17、STAT3、TGF-β1和 TNF-α mRNA表達比較Fig.6 Comparison of TSLP， Foxp3， IL-1α， IL-5， IL-6， IL-7， IL-10， IL-12， IL-17， STAT3， TGF-β1and TNF-α mRNA expression in thymus in each group

2.9 各組小鼠胸腺中TECs分布比較 免疫熒光結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠胸腺中髓質部分TECs（橙色陽性細胞）的數量減少，CK5及CK8表達量降低（P＜0.001，P＜0.01）；與模型組比較，CUMS-3組小鼠胸腺中髓質部分TECs（橙色陽性細胞）的數量進一步減少，CK5及CK8表達量顯著降低 （P＜0.01，P＜0.01），提示髓質中TECs的萎縮。 見圖7。

圖7 小鼠胸腺組織免疫熒光結果Fig.7 Results of immunofluorescence in mice thymus

2.10 各組小鼠胸腺中T細胞亞群變化 與正常組比較，模型組及CUMS-3組小鼠胸腺中CD3+CD4+CD8-及CD3+CD4-CD8+T細胞百分比均顯著升高（P＜0.05），CD3+CD4-CD8-及CD3+CD4+CD8+T細胞比例均顯著降低（P＜0.05），CUMS組在模型組的基礎上，變化趨勢更加明顯。提示腫瘤和慢性應激均使胸腺的陽性選擇功能和成熟T細胞向外周血輸出的過程受抑制。見圖8。

圖8 小鼠胸腺中T細胞亞群比例Fig.8 T cell subset ratio in mice thymus

2.11 各組小鼠胸腺TSLP、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、PI3K、p-PI3K蛋白表達比較 與正常組比較，模型組小鼠胸腺中p-JAK2、p-STAT3、PI3K、p-PI3K p55、p-PI3K p85表達均升高（P＜0.05）；與模型組比較，CUMS-3組p-PI3K p85、TSLP表達均升高（P＜0.05），p-JAK2、p-PI3K p55表達均降低（P＜0.05），提示腫瘤可能激活胸腺的JAK2/STAT3通路，而CUMS抑制JAK2及p-PI3K p55的磷酸化。見圖9。

圖9 各組小鼠胸腺中TSLP/STAT3通路及IL-7下游蛋白表達比較Fig.9 Comparison of expressions of TSLP/STAT3 pathway and IL-7 downstream protein in thymus in each group

3 討論

乳腺腫瘤，中醫屬于“乳巖”“乳石癰”“奶巖”等范疇，是在各種致瘤因素作用下，乳腺局部組織失去正常生長形態而導致的異常增生。《丹溪心法·卷五·癰疽》云：“不得于夫，不得于舅姑，憂怒郁悶，昕夕累積，脾氣消阻，肝氣橫逆，遂成隱核，如大棋子，不痛不癢，數十年后，方為瘡陷，名曰奶巖，以其瘡形嵌凹似巖穴也。不可治矣。”[17]表明乳腺癌與抑郁/焦慮等情緒失調有密切的聯系，并在發生發展過程中相互影響。本研究探討了乳腺癌和CUMS刺激下小鼠胸腺功能的變化，并試圖闡明其可能的作用機制。

研究表明，5-HT作為中樞系統中重要的神經遞質，參與睡眠、精神活動、情緒變化等生理反應，擾亂5-HT的釋放和重吸收，將導致抑郁障礙產生[18]。本研究中，CUMS-3組小鼠大腦5-HT水平明顯下降，且強迫游泳不動時間延長，說明小鼠發生情緒失調，因此后續實驗主要圍繞正常組、模型組及CUMS-3組開展。

TECs是胸腺中最主要的胸腺基質細胞，為胸腺細胞的發育提供最適宜的生存環境，是胸腺發揮功能的基礎[19]。CK5和CK8是TECs的特異性標志物[20-22]。 本研究結果提示，小鼠胸腺中TECs的CK5及CK8表達量降低，表明CUMS干預可能使小鼠TECs表型發生改變，導致上皮組織發生萎縮。

本研究發現，CUMS刺激對荷瘤小鼠的胸腺輸出功能有明顯的抑制作用，小鼠外周血TRECs降低，胸腺中T細胞亞群的比例紊亂。TRECs是T細胞受體（T cell receptor，TCR）基因重排過程中的副產物，與胸腺的輸出功能密切相關。通過定量分析樣本中單位數量T細胞中TRECs的水平，可以檢測胸腺近期輸出初始T細胞的數量，從而反映胸腺的輸出功能[23-24]。同時，機體免疫功能的正常狀態依賴于T細胞亞群數量和比例的平衡。CD3是所有T細胞表面的標志物，而具有輔助功能的CD4＋T細胞和具有殺傷功能的CD8＋T細胞是T細胞中最重要的兩類亞群，在胸腺細胞免疫調節中發揮著重要作用。本研究中，CUMS-3組小鼠T細胞亞群比例失調，胸腺輸出功能受限，T細胞的陽性選擇受阻，胸腺免疫功能出現下降，提示CUMS刺激下荷瘤小鼠胸腺輸出功能降低。

本研究進一步檢測了胸腺相關基因的表達，以探究CUMS影響胸腺功能的可能機制。IL-7可促進T細胞的分化、維持幼稚T細胞在胸腺中分化，并參與維持外周CD4＋、CD8＋T細胞等免疫細胞穩態。 TSLP作為一種IL-7樣細胞因子，可調節未成熟樹突狀細胞（dendritic cells，DC）激活、CD4+T細胞穩態和調節性T細胞發育[25-27]。同時，IL-7與抑郁也存在一定聯系，抑郁患者體內的IL-7水平降低，而且IL-7水平與抑郁程度呈負相關，可能是與抑郁相關的T細胞功能受損所致[16]。本研究中，CUMS刺激可特異性調控荷瘤小鼠胸腺內TSLP及IL-7水平。 Foxp3、IL-1α、IL-12、IL-6、IL-5、IL-10、IL-17、STAT3、TGF-β1及TNF-α同樣參與機體的免疫調節。研究表明，乳腺癌機體中Foxp3、IL-1α、IL-6、IL-12、IL-17、STAT3、IL-10、TNF-α、TGF-β1等因子表達明顯上調[28-32]，這與本研究結果一致，而CUMS干預后前述因子變化趨勢一致，未出現特異性改變，因此未進行更進一步的研究。以上結果提示，小鼠胸腺免疫功能的改變可能主要受TSLP及IL-7表達影響。免疫印跡結果顯示，CUMS刺激抑制了荷瘤小鼠體內受TSLP過度激活的JAK2-PI3K通路蛋白p-JAK2及IL-7下游蛋白p-PI3K p55的表達。既往研究證明，在乳腺癌機體中TSLP表達增加，并通過誘導抗凋亡分子Bcl-2的表達來促進腫瘤細胞的存活，并介導其轉移到肺部[14]。由此筆者推測，乳腺癌機體中TSLP表達增加，激活JAK2-STAT3通路，破壞了胸腺結構和輸出功能，導致胸腺功能紊亂；而抑郁情緒可能通過抑制過度活化的JAK2-PI3K通路，進一步破壞荷瘤機體的胸腺結構與功能，并進一步促進腫瘤細胞的存活和肺轉移，加速乳腺癌發病進程。

綜上所述，CUMS刺激下的乳腺癌小鼠會出現情緒失調，小鼠胸腺結構發生以髓質上皮組織萎縮為代表的損壞，胸腺輸出淋巴細胞的功能受到一定程度的抑制，其作用機制可能與抑制JAK2-PI3K通路有關。本研究結果將為乳腺癌的發生發展及其與情志的相互影響提供新的科學依據，為乳腺癌機體的胸腺免疫研究提供了新的方向。