β分泌酶-1基因甲基化與阿爾茨海默病的相關性研究

孫 蓉，肖 琳，宋明潔，何靜杰,賈建平

(中國康復研究中心 神經康復K2科，北京100068)

阿爾茨海默病(AD)是一種以記憶力明顯下降為主要表現的進行性神經系統變性疾病。流行病學和家系研究表明遺傳因素在AD的發病中占有很重要的地位[1]。近年來AD基因學的研究取得了很大的進展。已確定與AD有關的基因分別為淀粉樣APP(APP)基因[2-3]、載脂蛋白E(ApoE4)基因[4-5]、早老素1(PSEN1)基因[6]和早老素2(PSEN2)基因[7]。然而目前只有少數AD發現有這些基因的突變，并且部分突變并不致病[8]。以往的研究多側重于對DNA本身序列的關注，而有些表型和疾病的發生并非DNA序列的改變[9]。國內外研究發現部分基因啟動子區變異在某些人群中可能與AD的發病有關[10-12]。本研究檢測中國北方漢族人群BACE1基因啟動子區的甲基化水平，并通過遺傳學分析其與AD發病的關系，為AD的發病機制及今后臨床治療提供理論依據。

1 對象和方法

1.1 研究對象

研究分為散發性阿爾茨海默病(SAD)組、輕度認知障礙(MCI)組和對照組，SAD組35例(男17例，女18例)，平均發病年齡63.5±5.3歲。符合美國國立神經病、語言機能紊亂和卒中研究所及阿爾茨海默病和相關疾病協會對AD臨床診斷。一級親屬中無癡呆和精神病患者，屬散發病例。MCI組33 例(男14例，女19例)，平均發病年齡64.2±5.8歲。經MMSE評分、蒙特利爾認知評估量表(MoCA)、Hachinski缺血評分和門診系統體檢診斷。對照組22例(男11例，女11例)，平均年齡67.5±7.4歲，無記憶和智能障礙，MMSE評分>28分。3組間年齡、性別、教育程度上差異無顯著意義，均已簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

甲基化修飾試劑盒購自美國Chemicon公司。Taq HS熱啟動酶購自大連寶生物公司。Massarray點樣及芯片儀為美國Sequenom公司產品。PCR儀為美國ABI公司產品。GloMaxTM96微孔熒光分析儀為美國Promega公司產品。

1.3 方法

1.3.1DNA的提取及亞硫酸鹽修飾 抽取靜脈血10 ml，用枸櫞酸葡萄糖(ACD)抗凝，鹽析法提取DNA。用分光光度計分別測定260 nm、280 nm波長時的OD值。A260/A280比值大于2.0說明有RNA的污染，可用RNA酶處理樣品；比值小于1.8說明有蛋白質污染，可用酚-氯仿抽提。按照Chemicon甲基化修飾試劑盒說明對基因組DNA進行亞硫酸鹽修飾及純化回收。

1.3.2引物設計及PCR擴增 設計引物，擴增區域為BACE1啟動子區-407至+61，片段大小為468 bp。引物由上海生工合成，序列為Forward:GTTGGTTGTTTAGGTTATTATAATTTAGTT;Rev

ers:TAAATCTTCCCAAATCCCTAAATA。在正向引物5’端加入10mer tag，用于平衡PCR反應；反向引物5’端加入T7-Promoter 序列，用于后續的體外轉錄。以亞硫酸氫鹽轉化后的DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應條件：94℃變性15 min；94℃20 s，62℃30 s，72℃60 s，45個循環；72℃ 3 min；4℃ ∞。PCR反應產物使用2 μl堿性磷酸酶(SAP)處理，去除體系中游離的dNTP。

1.3.3體外轉錄及RNase A特異性T酶切 體外轉錄與酶切反應同時進行，反應體系包含SAP處理后PCR產物2 μl，RNase-free ddH2O 3.15 μl，5× T7 Polymerase Buffer 0.89 μl，T Cleavage Mix 0.24 μl，100 mM DTT,0.22 μl，T7 RNA & DNAPolymerase 0.44 μl，RNase A 0.06 μl。反應程序為37℃ 3 h，4℃ ∞。每個樣品中加水20 μl稀釋，震蕩混勻，加入6mg Clean Resin樹脂純化10 min，3 200 g離心5 min。

1.3.4質譜檢測 將純化后產物點至384孔芯片上，使用MALDI-TOF基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜分析技術，檢測數據通過EpiTYPER軟件(SEQUENOM)分析并輸出結果。

1.3.5重組質粒的構建及細胞轉染 以雙熒光報告基因系統(pGL3-Basic及pRL-TK)為報告基因載體，用基因重組技術構建含BACE1基因啟動子區的報告基因質粒，測序證實質粒構建成功。瞬時轉染人神經母細胞瘤(SH-SY5Y)細胞和人宮頸癌上皮(HeLa)細胞。在每次進行轉染的過程中，同時轉染pEGFP-N1質粒，觀察綠色熒光蛋白表達情況，以證實每次轉染的成功與否。

1.3.6細胞干預及相對熒光素酶活性檢測 選取S-腺苷甲硫氨酸(SAM)(復甲基化)、5-脫氧雜氮胞苷(5-aza-CdR)(去甲基化)、血清剝奪(降低能量和凋亡)及模擬AD病理環境(Aβ25-35)四種干預因素。轉染后24 h，用不同劑量的各種處理因素作用細胞24 h，用MTT法計算細胞活力，選取適合濃度進行細胞干預。用GloMaxTM96微孔熒光分析儀檢測LAF及LAR。相對熒光素酶活性(RLA)以表示不同啟動子質粒的轉錄活性。

1.4 統計分析

2 結果

2.1 啟動子區CpG位點分析

BACE1基因啟動子在-407 至+60區域有23個潛在甲基化位點。本次研究分析了前21個位點的甲基化水平(因檢測技術限制，CpG16和CpG23未能檢測)。

2.2 甲基化率的統計學分析

BACE1基因啟動子區大多數CpG位點甲基化程度很低，平均甲基化率小于10%。與MCI組和對照組相比，SAD組患者BACE1 啟動子在-167,-46,-19,+23和+28CpG位點甲基化率明顯降低(P<0.01)。MCI組與對照相比，各位點甲基化程度的變化均無統計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 BACE1基因啟動子區CpG位點的甲基化率

2.3 年齡與甲基化率的相關性

BACE1基因啟動子區平均甲基化率與年齡之間存在負性線性相關(相關系數R=-0.643，P<0.01)。隨著年齡的增長，甲基化程度逐漸降低(圖1)。

圖1 基因啟動子區甲基化率與年齡的相關性分析

2.4 不同處理因素下啟動子的轉錄活性

選擇SAM 255 μmol/L、5-aza-CdR 55 μmol/L和Aβ25-35 15 μmol/L作為最后的工作濃度，在這些濃度下細胞活力都在80%左右。對比各種處理因素下啟動子質粒的RLA，無論是在SH-SY5Y細胞中，還是在HeLa細胞中， BACE1啟動子質粒的轉錄活性在SAM干預下，與非處理組相比均明顯下降(P<0.01)。而在Aβ25-35干預下，BACE1啟動子質粒的轉錄活性與非處理組相比增加約20%，但這種變化僅在SY5Y細胞中(SY5Y細胞中P=0.000；Hela細胞中P=0.092)。雙熒光基因報告分析表明啟動子質粒在血清剝奪及5-aza-CdR干預下的RLA與非處理組相比均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 BACE1質粒在不同處理因素下的RLA比較

3 討論

AD是老年期癡呆的主要原因之一，由德國巴伐利亞精神病學家Alois Alzheimer在1907年首先描述并以其名字命名。病理上表現為腦組織萎縮，在新大腦皮質、海馬的神經元中有神經纖維纏結(NFTs)、細胞外老年斑(SP)和腦血管中淀粉樣蛋白(Aβ)沉積[13]。AD的病因目前尚不清楚，以往主要理論是唯蛋白假說(protein-only)，直接歸因于相關蛋白如β淀粉樣蛋白等的聚集作用，然而蛋白聚集發生在后期，AD的發生和發展不能完全用唯蛋白模型解釋[14]。

遺傳因素導致疾病的發生主要有兩大類機制：基因機制和表觀遺傳機制?；驒C制指基于基因序列改變所致基因表達水平變化，如基因突變、染色體丟失和重排；表觀遺傳機制是在基因的DNA序列和基因產物沒有發生改變的情況下，基因功能發生了可遺傳的變化，并最終導致了表型的變化。隨著AD遺傳學研究的逐漸深入，越來越多的證據向“基因決定論”提出了挑戰。FAD患者的研究[15]發現，即使具有完全相同基因組的兩個孿生子，發病年齡、臨床癥狀都不完全相同。這說明還有別的遺傳學機制在FAD發生過程中也起著重要的作用。遺傳學中的一個前沿領域：表觀遺傳學為人們提供了解答這類問題的新思路。1999年Wolffe[16]將表觀遺傳改變定義為未發生DNA序列改變的、可遺傳的基因表達改變。這些表觀遺傳的變化與老化、生活方式、環境暴露和遺傳因子密切相關，通過染色質重構、調控基因表達，影響細胞生理活性以及獲得疾病的危險性與嚴重性[17]。表觀遺傳調控機制主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA三種方式，其中以DNA甲基化修飾最為常見。DNA甲基化是生物體在DNA甲基化轉移酶(DNMTS)的作用下，以SAM為甲基供體,將甲基轉移到特定堿基上去的過程。

Lahiri DK[18]提出了“Latent Early-Life Associated Regulation”(LEARn)模型，假定特殊基因的潛在表達觸發了AD的發生和發展。根據這個模型，各種影響因素開始于早期階段，其長期的存在破壞了基因調節，如通過其轉錄機構干擾基因調節，導致相關蛋白過表達和隨后的Aβ沉積。這個模型主要作用于基因的調控區(啟動子)，通過特定基因啟動子內特定位點的甲基化起作用。

β分泌酶是一種轉膜天門冬氨酸蛋白酶—β位點APP裂解酶(BACE1和BACE2)，BACE1和BACE2被稱為新的轉膜天門冬氨酸(ASP)蛋白酶家族[19]。研究[20]表明由轉錄因子水平的變化造成BACE1 表達的升高可能部分地促進AD的病理進程，進一步導致AD發病。

本研究通過對35例AD患者、33例MCI患者和22例正常人外周血BACE1(-407 至+60)啟動子區甲基化程度的檢測，分析基因甲基化模式的改變在AD發病過程中所起的作用。BACE1基因在所研究的啟動子區域分別有23個甲基化位點。我們研究了21個位點，其中大多數CpG位點甲基化程度很低，平均甲基化率小于10%，與MCI組和正常對照組相比，SAD組患者BACE1 啟動子在-167,-46,-19,+23和+28CpG位點的甲基化程度明顯降低。MCI組與正常對照相比，各CpG位點甲基化程度的變化均無統計學意義。由此可見，特定基因啟動子區甲基化程度與SAD發病有明顯的相關性，BACE1可能通過甲基化改變基因轉錄水平，進一步影響淀粉樣蛋白β分泌酶的活性，從而導致AD發病。

本研究分析了甲基化水平與年齡的相關性，結果顯示BACE1基因(相關系數R=-0.643)啟動子區平均甲基化率與年齡之間存在負性線性相關。引起衰老的分子機制至少與兩個方面有關,其一是細胞損傷的積累，其二是衰老的相關基因。表觀遺傳修飾是重要的基因調控手段，其在衰老中起重要作用。隨著年齡的增長，基因甲基化程度逐漸降低，而高齡是AD的重要危險因素之一，因此推測DNA甲基化改變可能對AD發病起到一定作用。

基于以上理論和結論，為了進一步闡明BACE1基因啟動子區甲基化狀態的改變與AD的關系，我們進行了功能學研究。通過基因重組技術，構建了pGL-BACE1質粒。重組質粒轉染SH-SY5Y和HeLa細胞24 h后，進行了復甲基化(SAM)、去甲基化(5-aza-CdR)及血清剝奪(降低能量和凋亡)等四種干預處理。熒光素酶報告分析顯示，在SY5Y細胞中，BACE1啟動子質粒的轉錄活性在Aβ25-35干預下與非處理組相比增加約20%。說明β淀粉樣蛋白可以影響BACE1的表達。在雙熒光基因報告中，我們發現在SH-SY5Y細胞中啟動子的活性都較HeLa細胞中高，表明BACE1基因的表達具有神經細胞優勢性。

SAM是DNA胞嘧啶甲基化的主要供甲基來源。在轉移甲基過程中SAM脫甲基變成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)，SAH可被水解成HCY。在維生素B12(VitB12)催化下，5-甲基甲氫葉酸鹽把甲基遞給HCY使其變成蛋氨酸(Met)。Met和三磷酸腺苷(ATP)反應生成SAM，整個甲基循環就完成。AD患者的外周血具有高半胱氨酸、低VitB12和葉酸的特點[21]。我們通過瞬時轉染SH-SY5Y和HeLa細胞后的基因檢測，結果顯示復甲基化試劑SAM可引起BACE1啟動子啟動活性的改變。這個結果證實了DNA甲基化與基因表達呈負相關。其原因可能由于以下幾個方面：直接干擾特異轉錄因子和各種啟動子識別位點的結合；甲基化的DNA結合轉錄抑制因子引起基因沉默[22]；通過影響核小體的位置或與其染色體蛋白質相互作用而改變染色體的結構，介導轉錄抑制[23]；甲基化結合蛋白2(mecp2)C端的轉錄抑制區域(TRD)可以與染色體結合，改變染色質構型，并與組蛋白脫乙?；?HDAC)等蛋白共同調節基因轉錄[24]。

研究結果顯示，無論是在SH-SY5Y細胞中，還是在HeLa細胞中，每種啟動子質粒在血清剝奪和5-aza-CdR干預下的RLA與非處理組相比均無顯著性差異，即這些環境因素并沒有引起BACE1啟動子轉錄活性的變化。分析原因可能是由于啟動子對這些干預因素敏感性較低，以上變化尚不能引起其轉錄活性的改變；另一方面，也可能由于重組質粒中，BACE1啟動子區甲基化率低，5-aza-CdR去甲基化處理不能明顯改變甲基化狀態，因此不能明顯改變轉錄活性。并且，AD是一種多個環境因素共同作用導致的疾病，單一的一種環境因素尚不能成功模擬AD的病理環境；最后，由于本研究是在體外環境下進行的細胞學功能研究，而在體內各種因素的相互作用才是AD發生的真正環境，這也可能是導致出現以上陰性結果的主要原因。

通過以上的研究，我們發現了BACE1基因甲基化程度的改變與SAD發病有明顯相關性。SAM可以通過誘導甲基化抑制基因的轉錄活性，從而影響淀粉樣蛋白分泌酶的活性，進一步導致AD發病。

目前關于阿爾茨海默病表觀遺傳的研究取得一定的進展[25-27]，但認識還不夠，基因啟動子區甲基化在AD發生發展中所起的作用尚不清楚。甲基化可能會作為一個很好的分子標志[19]，對SAD的早期篩查，診斷和預測預后均具有重要的臨床意義，但尚需進一步的深入研究。