間充質干細胞外泌體促進糖尿病皮膚創口愈合的研究進展

趙 云,李秀英，納 濤，姜金蘭*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 科研中心,吉林 長春130033;2.中國食品藥品檢定研究院，北京102629)

中國糖尿病患病率高達11%以上，糖尿病會導致創口不愈合，糖尿病足等，為糖尿病患者帶來巨大的身體和精神創傷[1]。在糖尿病患者中，延遲創口愈合一直是一個主要的問題，約15%的糖尿病患者常常伴有不愈合潰瘍的風險[2]，據估計，這些難愈合性糖尿病皮膚創口的患者治療成本每年約為100億美元[3]。由此可見，開展促進糖尿病皮膚損傷愈合的相關研究，對提高我國乃至世界的糖尿病患者生存質量、降低致殘率有重要意義。

創口愈合通常經歷如下階段：止血、炎癥、增殖、收縮和重塑[4-5]。臨床及實驗研究發現，糖尿病創口的愈合過程與正常創口的愈合過程不同，糖尿病皮膚創口在愈合過程中會停滯在任意階段，導致創口難以愈合[6]。在糖尿病狀態下，由胰島素絕對或相對缺乏導致糖脂代謝紊亂，創口附近處于高糖、無氧的環境，細胞進行無氧氧化產生乳酸，創口附近pH降低，處于酸性環境，增加了感染的風險，是導致創口慢性長期炎癥進而影響愈合的重要因素[7-8]。同時，在糖尿病患者創口愈合的整個階段，創口長期處于氧化應激狀態，同時在慢性炎癥及其他因素的作用下，導致創口缺氧、血管新生異常、神經受損且表皮神經數量減少[9]、生長因子分泌減少、細胞外基質成分累積與基質金屬蛋白酶重構失衡等問題，是影響糖尿病創口愈合的重要原因。上述因素相互作用及促進，最終導致糖尿病患者創口愈合緩慢甚至不愈合。

臨床中治療糖尿病皮膚創口通過控制血糖、預防創口感染、抗炎，當糖尿病皮膚創口由于感染變得嚴重時，對患者創口進行及時清創、必要時進行介入甚至截肢等措施。傳統的治療方式對于全身狀況較差、病變較嚴重者的療效十分有限[10]。在使用抗生素控制感染時，還可能存在抗生素的濫用。近年來，國內外對各種干細胞及其衍生物治療難愈合性皮膚創口進行了大量的研究，研究表明，多種來源的間充質干細胞(MSC)及其衍生物可用于治療糖尿病難愈合創口，并且取得了顯著的療效[11]。本文主要對近5年MSC及外泌體(Exo)治療難愈合性皮膚創口的方式和相關機制展開綜述。

1 MSC促進難愈合糖尿病皮膚創口

在本世紀初，首次將MSC應用于治療糖尿病皮膚創口，取得了優異的治療效果。通過研究發現，MSC促進糖尿病皮膚創口愈合的機制分為以下3點，①可以分泌多種生長因子，促進皮膚創口處的血管形成[12]、促進膠原沉積[13]。②MSC可以促進機體各種類型的細胞增殖和分化。③MSC可以分泌具有組織修復功能的外泌體。

不同來源的MSC能夠不同程度促進糖尿病皮膚創口的愈合。骨髓間充質干細胞[14](BM-MSC)、人臍帶血間充質干細胞[15](hMSCs)、脂肪來源的間充質干細胞[16](AD-MSC)均能夠促進STZ誘導的糖尿病大鼠模型進行全皮膚層切除的皮膚創口愈合，以上研究均表明，不同來源的 MSC都能有效的促進糖尿病創口的愈合。

目前研究表明，MSC促進糖尿病創口愈合的機制較為復雜，可能涉及多個系統和通路促進糖尿病皮膚創口的愈合，其中MSC可能通過促進血管生成，調節創口處微環境，促進膠原沉積，調節多種因子，最終促進糖尿病皮膚創口的愈合。

1.1 MSC通過分化促進糖尿病皮膚創口愈合具有自我更新和修復能力的MSC是一種多能干細胞，在組織工程學、胚胎工程、細胞工程、基因工程中MSC受到了廣泛的應用。MSC被移植到創口后，在一定的條件下，可以促進機體產生各種類型的細胞，如肌成纖維細胞、角化細胞、內皮細胞等參與創口的愈合[17-18]。

1.2 MSC分泌因子促進糖尿病皮膚創口愈合MSC能夠產生多種與促進創口愈合相關的因子，如膠原Ⅰ型、血小板衍生生長因子(PDGF)、生長分化因子-11(GDF-11)、血管內皮生長因子(VEGF)、上皮生長因子(EGF)、肝細胞生長因子(HGF)等。Mona Saheli等[19]發現，成纖維細胞是一種在愈合中起關鍵作用的細胞。將MSC培養基用于治療糖尿病創口時，可以使成纖維細胞活力增高，并且bFGF基因表達明顯提高，以此促進創口的愈合。Linhao Wang等[20]通過細胞外基質(ECM)包被MSC，增強生長因子VEGF、PDGF、HGF、GDF-11和EGF的表達，能夠促進創口的愈合。以上研究證明了MSC能夠通過分泌多種因子有效的促進糖尿病創口的愈合。

2 MSC來源的Exo用于治療糖尿病創口

MSC可以通過直接分泌和旁分泌的方式釋放Exo等多種活性物質，激活損傷部位的細胞修復、募集內源性干細胞產生保護或再生機制，改善局部缺氧微環境，還可以通過增加膠原沉積、促進血管生成、減少纖維化和抑制炎癥反應等，對組織進行修復[21]。MSC及其衍生物的移植成為治療難愈合性糖尿病皮膚創口的新希望。因此，MSC及其衍生物通過改善皮膚創口的血供及微環境，達到治療難治性糖尿病皮膚創口的目的[22-23]。

Exo屬于細胞外囊泡(EVs)的一類，其直徑大小為30-200 nm[24-27]。Exo是通過胞吐釋放到細胞外，并且攜帶有蛋白質和遺傳物質，包括脂類、膜蛋白、核蛋白、核酸，這些物質可以有效地調節長距離或短距離的細胞間通訊，提供了與各種生理和病理過程相關的重要信息[28]。研究表明MSC分泌的Exo具有相當于或大于MSC本身的組織修復能力。更重要的是與細胞移植相比，Exo介導的無細胞治療提供了更多的安全性，降低了MSC移植導致的異位組織形成的風險和免疫排斥的可能性[29]。Exo有望成為治療糖尿病難愈合創口更安全有效的方法。

Exo用于糖尿病創口的治療是一項較為新穎的研究思路，根據Exo的來源和性質，通過與其他材料或者藥物協同使用，能夠發揮更好的治療效果。目前的研究中，已經發現不同細胞來源的Exo可以增加血管的生成促進難愈合性糖尿病皮膚創口的修復，Exo還可以通過不同的機制促進糖尿病皮膚創口的愈合。

2.1 促進纖維細胞的生長和遷移Arsalan Shabbir等[30]使用bMSCs來源的Exo治療糖尿病創口，研究發現bMSCs來源的Exo可以促進糖尿病皮膚創口中成纖維細胞的生長和遷移，促進糖尿病皮膚創口的愈合。Eun Wook Choi等[31]研究表明人脂肪干細胞來源的外泌體(ASC-exo)能刺激人真皮成纖維細胞(HDFS)的再生。在蛋白質水平上，與皮膚再生相關的基因，如CD34、膠原Ⅰ型、彈性蛋白和角質形成細胞生長因子(KGF)的表達升高。在RNA中，ASC-exo含有可抑制NPM1、PDCD4、CCL5和NUP62等基因的miRNA，刺激真皮成纖維細胞的增殖，促進皮膚成纖維細胞的再生。

2.2 促進細胞因子高表達Jinwen Liu等[32]也發現hMSCs來源的Exo含有生成素-2(Ang-2)，作用于糖尿病創口中可以有效的促進創口的愈合。Eun Wook Choi[33]等發現口腔黏膜表現出獨特的再生特性，有時被稱為胎兒樣創口愈合。從人口腔上皮細胞中提取的Exo，可以導致纖維細胞增殖呈劑量依賴性減少，生長因子如HGF、VEGFA、FGF2和CTGF基因表達顯著增加。這些指標都顯示口腔黏膜上皮細胞來源的Exo可以促進創口的愈合。Mengdie Li等[34]發現巨噬細胞來源的Exo可以抑制創口附近的TNF-α和IL-6的分泌，降低糖尿病創口的炎癥反應。

2.3 促進皮膚再上皮化Exos可通過誘導內皮細胞增殖和遷移來加速創口愈合過程，以促進糖尿病創口的血管生成，降低炎癥反應，促進血管形成和創口的再上皮化，加速糖尿病創口的愈合。Yin Hu等[15]發現將hMSCs分泌的Exo移植到小鼠的皮膚創口處，可促進再上皮化，減少瘢痕，促進血管生成。值得注意的是miR-21-3p在Exo中被發現高度富集，miR-21-3p是抑制磷酸酶、張力素同系物(PTEN)和發芽同系物1(SPRY1) 的關鍵介質，是創口愈合的重要調節物質。Chun-Yuan Chen等[35]發現由人尿源性干細胞分泌的外泌體(USC-Exo)，通過富集促進創口愈合的蛋白質，促進創口再上皮化，增加膠原蛋白的沉積，從而有效促進傷口的愈合。

通過以上的研究表明，不同細胞來源的Exo通過不同的機制均可以有效的治療難愈合性糖尿病創口。

3 Exo聯合藥物和材料更有效的促進糖尿病皮膚創口的愈合

許多研究表明，除了直接使用Exo外，Exo與不同生物材料、納米顆粒、藥物聯合使用，通過控釋、物理吸引等方式，有效的提高了Exo治療糖尿病難愈合創口的治療效果。

3.1 Exo聯合阿托伐他汀(ATV)Muyu Yu等[36]使用阿托伐他汀處理后的bMSCs提取外泌體(ATV-Exos)，在治療糖尿病皮膚創口時，ATV-Exos促進創口再生的能力優于Exos，同時ATV-Exos和Exos在形態、結構和濃度上沒有顯著差異。ATV-Exos通過激活AKT/e NOS通路，miR-221-3p顯著上調，促進血管的生成，最終有效的促進了糖尿病創口的愈合。

3.2 Exo聯合高分子材料高分子材料具有良好的生物相容性，可用于Exo緩釋作用。Quan Shi等[1]從牙齦間充質干細胞(GMSCs)中提取的Exo與殼聚糖/絲基水凝膠海綿相混合治療創口。由于水凝膠可以提供封閉無菌的環境，有效降低了感染的風險。水凝膠的緩釋功能，能夠有效延長Exo在創口處的保留時間，能夠促進糖尿病創口的愈合。Min Wang等[37]制備了一種熱敏性、可注射性、自愈性和粘著性的基于多糖的水凝膠支架，具有高效的抗菌活性、快速的止血能力、良好的紫外線屏蔽性能，與Exo相結合(FEP@exo)可以適應糖尿病創口的酸性環境，達到控制釋放Exo，可以有效地促進瘢痕組織形成和皮膚附件的愈合。Chenggui Wang等[38]開發了一種可注射、自愈和抗菌的基于多肽的水凝膠,能有效控制Exo的釋放，加快血管生成效率，顯著提高了糖尿病全厚度皮膚創口的愈合效率。

3.3 Exo聯合納米粒子納米粒子通過不同的修飾或外源引導具有靶向性，Exo聯合納米粒子可以使Exo更多的聚集在皮膚創口附近，產生更好的治療效果。Xiuying Li等[39]制備了氧化鐵納米粒子標記的外泌體(ExoNPs)，在尾靜脈注射ExoNPs后通過磁鐵誘導其積累在創口部位，這些積累在創口處的ExoNPs通過增強內皮細胞的增殖、遷移，促進血管的形成，增加了促細胞增殖因子CK19、PCNA和膠原在體內的表達，促進了糖尿病創口的愈合。該研究通過磁鐵吸引Exo所包裹著的納米顆粒，增加了Exo在體內的趨向性，使其積累在創口部位，顯著增強療效，促進創口的愈合。

4 總結

糖尿病皮膚創口的發病機制極為復雜，創口處微環境長期處于酸性、缺氧、慢性炎癥等不利于愈合的因素下，傳統治療手段存在較大的局限性，往往不能達到令人滿意的治療效果。研究表明，MSC作為一種多能細胞，具有強大修復作用，同時Exo作為MSC的一種衍生物，能夠促進血管形成、膠原沉積、再上皮化，減少感染、降低炎癥反應，改善了糖尿病創口的局部微環境，促進創口的愈合，在治療糖尿病皮膚創口取得良好的治療效果，并且通過與各種生物材料、納米粒子結合能夠更好的發揮治療效果。雖然目前MSC還不能直接用于治療患者，其中安全性和倫理道德存在較大的爭議，但隨著MSC作用機制不斷明確，Exo提取工藝的不斷進步，更好地與各種生物材料、納米顆粒、藥物等相結合，上述問題一定會逐步改善。MSC及其衍生物在臨床治療上的前景將非常廣闊，這必將給糖尿病難愈合皮膚創口的患者帶來更有效的治療方式。