肺結核病患者單核細胞P糖蛋白、MRP表達與耐藥關系分析

馬清艷，劉曉飛，侯莉莉，丁 微，侯永華

(河北省胸科醫院 1.結核四科；2.結核五科；3.內分泌科,河北 石家莊050041)

我國是結核病的高負擔國家之一，耐藥肺結核病人治療極其困難，目前世界上仍缺乏敏感性藥物[1]。然而耐多藥肺結核病人的治療周期長達18-24個月，嚴重者治療周期達3年以上，且只有約一半的患者被治愈[2-3]，耐藥肺結核已成為我國乃至世界各國結核病防治工作的難題。報道顯示[4-5]，參與肺結核病耐藥相關基因較多，而單核細胞P糖蛋白(Pgp)與多藥耐藥相關蛋白(MRP)等基因在耐藥性中發揮重要影響。因此，本研究進一步探討了Pgp、MRP在肺結核病中的表達情況，分析其與多藥耐藥的相關性,現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選自2019年1月-2020年10月于河北省胸科醫院就診的肺結核患者144例，其中耐藥組92例，初治結核病組52例。男82例，女62例，年齡18-64歲，平均年齡(43.5±5.8)歲，病史1-8年，平均(3.7±1.1)年。同時健康體檢者50例為對照組，男28例，女22例，年齡18-65歲，平均年齡(42.4±5.3)歲。納入標準：①近8周內痰結核分枝桿菌培養呈陽性(耐藥者藥敏試驗符合中華醫學會結核病學分會制定的耐多藥肺結核診斷標準)；②CT檢查提示肺結核病灶。排除標準：①廣泛耐藥的肺結核病患者；③合并嚴重心、肝、腎功能異常者；④認知功能障礙、孕期或哺乳期女性。兩組在性別、年齡等資料方面組間不具有統計學意義(P>0.05)，有可比性。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》中的相關要求，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1試劑與儀器 反轉錄試劑盒(美國Promega公司)，Trizol試劑(美國Invitrogen公司)、Real-time PCR反轉錄試劑盒(上海耕欣生物科技有限公司)。PCR儀(ABI7500型)(美國ABI公司)，恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器廠)，核酸蛋白測定儀(德國eppendorf公司)。

1.2.2提取樣本RNA 收集研究對象空腹 8 h 的肘靜脈血 6 ml 于 EDTA 抗凝管中。所有 EDTA 抗凝管收集的全血，采用Trizol法提取樣本總RNA。以260 nm為波長，加入2 μl樣品，采用核酸定量儀測定OD260和OD280，調整樣品體積使得OD260和OD280比值在1.8-2.1之間。

1.2.3目的基因mRNA表達量檢測 ①將RNA反轉錄為cDNA：將需要的RNA樣品和反轉錄試劑混合均勻。于0.2 ml EP管中加入1 μg模板總RNA、1 μl rand promers、1μl oligo(dT)15 primers，補Nuclease-Free water至10 μl。將EP管置入PCR擴增儀中，70℃處理5 min，處理后再次將EP管置入PCR儀中進行25℃(5 min)、42℃(60 min)、70℃(15 min)反轉錄，獲取產物cDNA。②cDNA擴增：以合成的cDNA為模板，按8Strip Caps進行基因擴增。將體系管置于PCR儀中，反應條件95℃預變性(10 min)、95℃(15 s)，60℃(1 min)為反應條件循環40次。采用ABI7500軟件調整基線和閾值，每個上樣孔設2個復孔，重復3次，讀取ct值。目的基因相對表達量采用2-△△CT法分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 Pgp、MRP在肺結核病中的表達

Pgp、MRP在肺結核病組表達量及陽性率均高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.001)。見表1。

表1 Pgp、MRP在肺結核病中的表達

2.2 Pgp、MRP在肺結核病耐藥組與初治結核病組中的表達

耐藥組Pgp、MRP表達量及陽性率均高于初治結核病組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2、表3。

表2 Pgp在肺結核病兩組中的表達

表3 MRP在肺結核病兩組中的表達

2.3 耐藥影響因素的單因素及多因素分析

單因素分析顯示，耐藥組與結核病組在年齡、性別、居住地、職業、是否有糖尿病及治療時間比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。多因素分析顯示，以患者耐藥作為自變量，單因素及Pgp、MRP表達量作為因變量進行非條件Logistic 回歸分析，結果顯示年齡、居住地、Pgp、MRP表達量是肺結核病患者耐藥的主要影響因素。見表5。

表4 耐藥影響因素的單因素分析

表5 耐藥影響因素的多因素分析

3 討論

2018年WHO發布的全球結核病報告結果中，2017年全球新發結核病者1000萬，耐利福平和耐多藥者56萬[6-7]。耐藥結核病治療周期長、花費大，且治愈率低、病亡率高。因此，耐藥結核病的預防和控制已成為世界慢性病防治的關注重點。目前，耐藥結核病的臨床治療主要通過患者用藥史及藥敏試驗選擇耐受性好、安全性高的二線藥物或療效不明確藥物，未能達到滿意的治療效果[8]。經統計顯示[9-10]，初治的結核病患者約50%-60%的患者多發生耐藥，醫療花費大，導致患者負擔增加，醫療資源浪費。因此，應強化對于肺結核病耐藥機制的研究，提高治療有效率，改善預后。

肺結核病耐藥機制相對復雜，而Pgp和MRP是近年來受廣泛關注的跨膜轉運蛋白。MRP是位于細胞膜上的能量依賴的溢出泵，能夠將進入肺部細胞內的多種藥物泵出細胞外，導致多藥耐藥[11-13]。Pgp是由MRP編碼產生，也位于細胞膜上的能量依賴溢出泵，同樣可以把細胞內的藥物泵出細胞外，使肺細胞耐藥。本研究顯示，Pgp、MRP在肺結核病組表達量及陽性率均高于對照組(P<0.05)。同時耐藥組Pgp、MRP表達量及陽性率均高于初治結核病組(P<0.05)。表明Pgp、MRP可能參與了肺結核病及耐藥性的發生。何飛歌等[4]報道顯示，耐多藥肺結核患者血清Pgp蛋白表達上調，而通過利奈唑胺治療后，血清Pgp蛋白表達下降，這也說明血清Pgp蛋白與肺結核耐藥相關。分析可能是由于血清Pgp蛋白表達陽性，可通過主動運輸方式將親脂疏水類抗菌藥物轉運至細胞外而發生耐藥[14]。有研究表明[15]，Pgp 的表達水平與細胞耐藥性呈正相關。MRP蛋白能夠刺激細胞DNA調控因子或轉錄因子的激活，以及通過配體結合的信號通路機制，促進囊泡的釋放，并增強囊泡包裹肺細胞內藥物的能力，促進藥物的排出。

在探討不同的臨床特征對肺結核病患者耐藥的影響過程中初步發現，年齡、農村、Pgp、MRP表達量是影響多藥耐藥的危險因素，原因可能是，年齡大，機體抵抗力下降，可能與其易受到外源性感染有關。而農村患者更易發生耐藥，可能與其防病意識弱，治療不及時以及用藥不規范等因素有關。而Pgp、MRP表達陽性是肺結核病患者耐藥的獨立危險因素。但由于本研究收集例數相對較少，上述各因素的相關影響仍需要進行更深入的研究。

綜上所述，Pgp、MRP表達在肺結核病患者呈高表達，是肺結核患者耐藥的獨立影響因素。