蒙藥驗方《亞日飲湯》提取物對H37RV感染小鼠血清IFN-γ的影響

布仁特古斯，陸 宇，馬媛媛，照 娜，烏日古瑪拉，圖門烏力吉*

(1.內蒙古醫科大學蒙醫藥學院，內蒙古 呼和浩特010010；2.北京市胸科醫院 藥物實驗室；3.內蒙古醫科大學附屬醫院 蒙醫科)

結核病目前仍然是嚴重威脅人類健康的重大傳染病之一[1]，也是當下僅次于新型冠狀病毒肺炎的第二大單一感染源致死原因，對全人類生命健康造成重大威脅[2-4]。2021年10月14日，世界衛生組織(WHO)發布了《2021年全球結核病報告》，全球因新冠肺炎大流行引起結核診治服務供需中斷，導致結核病死亡人數增加、發病率下降趨勢緩慢。我國2020年估算的結核病新發患者數為84.2萬，在30個結核病高負擔國家中我國估算結核病發病數排第2位[5]。因此研發高效、低毒、無耐藥、廉價的抗結核新藥仍是當務之急。從豐富的民族醫藥資源中尋找有效的抗結核藥物，已引起越來越多國內外研究者的重視[6]。機體在清除結核分枝桿菌過程中CD4+Th1和CD8+T細胞介導的細胞免疫及其分泌的細胞因子如IFN-γ、IL-12起重要作用[7]，《亞日飲湯》是治療頸部淋巴腺結核蒙藥驗方，其作用機理至今不清。研究發現該藥體外并無抗結核桿菌作用，其代謝產物亦無直接抑制結核桿菌作用[8]。對于結核病體液免疫并無保護作用[9]，因此，認為該藥可能通過提高機體細胞免疫功能來發揮治療結核病的作用。結核病的發病與多種免疫細胞和細胞因子相關，資料顯示IFN-γ是與結核病細胞免疫關系最密切的細胞因子[10]，故本研究通過氣溶膠建立H37RV感染小鼠模型，給予亞日飲湯治療后，采用ELISA法測定血清IFN-γ的水平，間接了解該藥對細胞免疫功能的影響，預期揭示該藥的可能作用機理。

1 材料與方法

1.1 試劑去離子水、1×PBS、2N H2SO4、吐溫-20。ELISA檢測試劑盒：ELISA MAXTMDeluxe Set Mouse IFN-γ kit購于Biolegend公司。包被板：ELISA MAXTMUncoted Plates購于Biolegend公司。密封膜、1.5 ml離心管。

1.2 方法

氣溶膠感染制備小鼠急性結核病模型，BALB/C小鼠，雄性，體重18-20 g，60只，分空白組；模型組；異煙肼組；亞日飲湯低、中、高劑量組，共6組，每組10只。亞日飲湯提取物小鼠灌胃，高劑量組每日每只216 mg一次灌胃，中劑量組每日每只108 mg一次灌胃，低劑量組每日每只54 mg一次灌胃，陽性藥物組(異煙肼)20 mg/kg·天，空白組和模型組給予相同體積生理鹽水(不超過1 ml)每日1次，造模后治療28天。取腹主動脈血1 ml，室溫靜置凝血后以離心半徑 3 cm，3 000 r/min離心20 min，取上清，滅活后過濾除菌保存，采用ELISA方法檢測小鼠血清中IFN-γ，實驗步驟按照“ ELISA MAXTM Deluxe Set Mouse IFN-γ ”檢測試劑盒說明書進行。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 制作標準曲線標準品OD450-OD570差值的均值及設定的濃度值數據見表1，通過散點圖添加趨勢線的方法，制作標準曲線見圖1。

表1 標準品OD450-OD570差值的均值及設定的濃度值(pg/ml)

圖1 血清IFN-γ

2.2 根據標準曲線計算樣品濃度以OD450—OD570的差值為x值，代入標準曲線y=866.6x-37.06，y值即為樣品濃度見圖2，模型組、亞日飲湯高、中、低劑量組的水平高于空白組、異煙肼組(P<0.05)，亞日飲湯高、中、低劑量組的水平高于模型組(P<0.05)。見表2。

圖2 血清IFN-γ

表2 血清IFN-γ濃度在空白組、模型組、異煙肼組、亞日飲湯組表達水平比較

3 討論

結核分支桿菌感染機體后是否發病取決于結核菌的數量、毒力和機體的免疫狀態，細胞免疫在抗結核保護性免疫中起主要作用[6]。IFN-γ可增加感染了結核分支桿菌的巨噬細胞活性氧中介物(ROI)和活性氮中介物(RNI)的產量來殺傷細菌[11]，IFN-γ還能增加高親和力Fc受體在單核細胞、巨噬細胞表面表達，促進這些細胞參與抗體依賴的細胞毒反應[12]。IFN-γ是機體發揮抗結核保護性免疫的重要細胞因子，其在機體的水平與結核的發生、發展、病程密切相關，它可通過促進T細胞的增殖和分化，激活巨噬細胞，參與結核病的肉芽腫免疫反應等多方面發揮抗結核免疫作用[13]。IFN-γ在活動性肺結核患者中存在明顯缺陷，導致個體肉芽腫形成少且組織壞死嚴重[14]。研究結果顯示許多中藥具有提高細胞免疫功能，從而有間接治療結核病作用[15]。中草藥免疫治療主要是非特異性調整人體免疫功能，如黃芪多糖、枸杞子多糖、刺五加多糖等能促進IL-2、IL-3、IFN-γ 等細胞因子的分泌，明顯地提高機體的細胞免疫和體液免疫功能[16-17]。本研究結果顯示血清IFN-γ在亞日飲湯高、中、低劑量組的水平均高于空白組、模型組、異煙肼組(P<0.05)，證明亞日飲湯具有提高小鼠血清IFN-γ水平的作用，異煙肼組水平低于空白組，可能與異煙肼屬于一線抗結核藥物，具有直接殺傷結核桿菌作用，并非與提高免疫功能有關，空白組水平低于模型組，因空白組未曾受到H37RV感染，故只表現出固有免疫狀態，模型組水平高于空白組和異煙肼組，是因模型組受到H37RV感染后，血清IFN-γ水平有所升高，表明小鼠原有免疫狀態，但其水平升高明顯不及亞日飲湯組。綜上所述，我們認為亞日飲湯可以提高H37RV感染小鼠模型血清中的IFN-γ水平，可能是該藥治療結核病作用機制之一。