甘肅省積石山縣紅細胞血型基因分布及精準輸血中臨床研究

羅強軍 劉春霞 柴翠翠 林婧 張紅良

摘要：目的：對甘肅省少數民族地區不同民族433例血液標本進行RH（C/c/E/e）、Lewis（Lw/Lw）、Duffy（Fy/Fy）等12種紅細胞血型基因檢測分析，為我省少數民族血液學研究、臨床輸血安全及稀有血型庫建設等提供數據支撐，應用于精準輸血醫學。方法：對433例標本用熒光PCR法進行血型基因檢測分析和統計，使血型基因分型應用于精準輸血醫學。結果：多數表型各民族間符合Hardy-Weinberg平衡法則（P>0.05），無統計學意義；CC、MN頻率：回族>其他>漢族；Cc、Ee頻率：漢族>其他>回族；Kell、Colton、Dombrock、Yt血型系統中，罕見表型Kpa+b+、Coa+b+、Doa+b+、Yta+b+均為：其他>回族>漢族，且漢族中未發現Coa+b+、Yta+b+兩種表型，經過χ2值運算民族之間具有統計學意義（P<0.05）。結論：甘肅省少數民族地區人群RHCE、MNS、Duffy、Kidd、Diego和Dombrock血型系統抗原基因頻率呈多態性分布，Lw、Scianna、Kell、Colton、Yt和Lutheran血型系統呈單態性分布，罕見表型Kpa+b+、Coa+b+、Doa+b+、Yta+b+民族之間存在著差異（P<0.05），有統計學意義。

關鍵詞：紅細胞血型；血型抗原；血型基因；基因分型；RhEC；精準輸血

中圖分類號：R55文獻標志碼：A

血型是分布在紅細胞膜上的特異性抗原，是人類的重要遺傳標志，具有遺傳多態性，在臨床輸血安全性中發揮著決定性作用。1900年ABO血型的發現開創了免疫血液學（Immunohematolgy），開啟了輸血醫學先河；隨著分子生物學技術發展，血型檢測已進入了后基因組時代，即血型基因組學（Blood group genomics）[1]。截至2021年2月，國際輸血協會（International Society Blood Transfusion ISBT）發現并命名的紅細胞血型系統有43個，共343個抗原，部分紅細胞血型抗原在人群中的分布頻率小于1%，稀有血型患者存在巨大的生存危機，即當需要輸血治療時不易找到相容的血液，當找不到相容血液時，可能會引發溶血性輸血反應或新生兒溶血病等，出現溶血、孕婦早產等癥狀，嚴重者導致患者死亡。對人群進行血型篩查，特別是部分少數民族，其可能具有獨特的遺傳特征，在少數民族地區建立紅細胞稀有血型數據庫，為臨床選擇配合型血液輸注提供依據，同時可以有效避免上述情況的發生。紅細胞血型基因多態性的研究在精準輸血醫學（Precision transfusion medicine）中扮演著重要角色[2-3]。國內對少數民族人群稀有血型研究甚少，其可能具有獨特遺傳特征，為探討少數民族人群紅細胞的RhCE、Lw、Duffy、Kidd、MNS、Scianna、Colton、Dombrock、Kell、Diego、Yt和Lutheran血型系統基因頻率分布情況，本研究采用熒光PCR技術對433例甘肅省少數民族地區人群血型基因進行檢測分析，調查自治區人群12個稀有血型系統抗原基因頻率及表現型頻率的分布特點，為紅細胞稀有血型庫建設等方面提供一定的數據支持，同時為該少數民族人群制定個體化的輸血治療方案提供依據，并提高輸血的安全性和精確性。

1對象和方法

1.1研究對象

收集2017年5月至2019年6月甘肅省臨夏回族自治州積石山保安族東鄉族撒拉族自治縣人群標本433例，其中回族195例，漢族149例，其他89例（包括東鄉族71例，撒拉族7例，藏族5例，保安族4例，土族1例，布依族1例），采用EDTA抗凝真空管采集標本2～3 mL，進行血型基因檢測，原始數據及檢測記錄完整。本研究已征得蘭州大學第一醫院倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑

血型基因檢測、DNA提取等實驗所需試劑盒：人類紅細胞稀有血型基因分型檢測試劑盒（江蘇中濟萬泰生物醫藥有限公司，批號20180819）；熒光PCR儀（德必基生物科技（廈門）有限公司，型號TBG一Q6000，DNA提取試劑盒廠家TBG，批號C011712R0）；醫用低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，Mini一10K）；臺1式冷凍離心機（久保田公司，S700TR）；紫外分光光訓度計（Merinton，SMA4000）；核酸純化儀（杭州博日科技有限公司，NPA32P）；漩渦混勻器（金壇區白塔新寶儀器廠，XH-T）。

1.3檢測方法

對32種臨床重要的紅細胞抗原基因設計專一性引物，結合SYBR Green I進行實時熒光PCR擴增及熔解曲線反應，詳細見圖1，當引物序列與待測序列互補時，通過PCR反應將目的片段復制與放大，再通過熔解曲線的熒光信號與溫度變化，檢測特異性產物在雙鏈解離50%時的溫度（Tm）。PCR體系中加入內參（IC），用于評估樣本質量及PCR抑制因素。按照人類紅細胞稀有血型基因分型試劑盒（熒光PCR法）（江蘇中濟萬泰生物醫藥有限公司）的說明書操作步驟進行基因分型。首先配制反應液，加入PCR濃縮液管中，與工作液混勻。每孔加樣10μL，封膜后置入96孔板進行PCR擴增和熒光檢測。以熒光PCR軟件開啟數據，利用陽性、陰性的Tm判斷值范圍找出陽性的孔。結合型別判讀表，直接判讀陽性陰性結果1。

1.4統計分析

采用SPSS22.0統計學軟件進行統計學分析。結果以頻率、構成比指標表達，計量資料以3組間比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析，以P<0.05表明具有顯著性差異并且有統計學意義

2結果

（1）該地區RHCE、MNS、Duffy、Kidd、Diego和Dom？ brock血型系統抗原基因頻率呈多態性分布，Lw、Scian？ na、Kell、Colton、Yt和Lutheran血型系統呈單態性分布。

甘肅省臨夏回族自治州積石山保安族東鄉族撒拉族自治縣人群進行12種血型系統基因檢測，433例標本中等位基因頻率分布為：C=0.7875，c=0.6097，E= 0.4919，e=0.9053，Lwa=0.9977，Lwb=0，Fya=0.9954，Fyb= 0.1963，Jka=0.7344，Jkb=0.7783，M=0.7344，N=0.6074，S= 0.097，s=0.9053，Mur=0.0116，SC（-1，p2）=0，Dia=0.06，Dib=1.0000，Wra=0.0046，Wrb=0.8614，K=0，k=0.9977，Kpa=0.0323，Kpb=1.0000，Coa=1.0000，Cob=0.0092，Doa= 0.254，Dob=0.9815，Lua=0.2009，Lub=1.0000，Yta=1.0000，Ytb=0.023；其中等位基因頻率分布狀況，RHCE、MNS、Duffy、Kidd、Diego和Dombrock血型系統抗原基因頻率呈多態性分布，Lw、Scianna、Kell、Colton、Yt和Lutheran血型系統呈單態性分布。其中等位基因c頻率分布：漢族>其他>回族；等位基因N頻率分布：其他>漢族>回族；等位基因Kpa、Coa、Cob、Doa均為其他>回族>漢族，且漢族中未發現等位基因Cob；c、N、Kpa、Coa、Cob、Doa等位基因的頻率在漢族和少數民族之間存在一定的差異，且均為P<0.05，具有統計學意義。等位基因Lwb、SC（-1，p2）、K頻率各民族均為0，等位基因Cob漢族中也未檢測到，等位基因Dib、Kpb、Coa、Lub、Yta頻率各民族均為100%，除以上七種外其他的等位基因在各民族之間差異符合Hardy-Weinberg平衡法則（P>0，05），無統計學意義。見表1所列。

（2）該地區罕見血型表型Kpa+b+、Coa+b+、Doa+b+、Yta+b+民族之間存在著差異。

通過對甘肅省臨夏回族自治州積石山保安族東鄉族撒拉族自治縣人群12種稀有血型系統抗原基因40種表型頻率分布的Hary-Weinberg吻合度檢驗，其中29種表型各民族間符合Hardy-Weinberg平衡法則（P>0，05），無統計學意義。CC、MN頻率：回族>其他>漢族；Cc、Ee頻率：漢族>其他>回族；Kell、Colton、Dombrock、Yt血型系統中，罕見表型Kpa+b+、Coa+b+、Doa+b+、Yta+b+均為：其他>回族>漢族，且漢族中未發現Coa+b+、Yta+b+兩種表型，經過χ2值運算這幾種表型均為P<0.05，民族之間存在著差異，均有統計學意義，可能由于少數民族起源、居住環境相對隔離、宗教信仰、通婚習俗及人群遷徙等因素的影響，使得部分血型表型具有自身的遺傳特征，這對人類遺傳學的研究具有重要的意義。具體數據見表2所列。

3討論

本研究通過對甘肅省少數民族地區人群12種稀有血型系統抗原基因分布頻率進行χ2檢驗，多數血型系統符合Hardy-Weinberg平衡法則（P>0.05），其中抗原C、c、E、e的抗原陽性頻率分別為：78.75%、60.97%、49.19%、90.53%（表3），這與丁佳棟[4]“蘭州地區獻血員Rh血型抗原及RhCE基因分布”結果類似，但對于部分罕見抗原如：S、Kpa、Cob、Lua的抗原頻率分布在民族之間存在差異，少數民族抗原陽性比例明顯高于漢族，且之間的差異具有統計學意義（P<0.05）。抗原基因頻率分布分析發現：RHCE、MNS、Duffy、Kidd、Diego和Dom？ brock血型系統基因頻率呈多態性分布；Lewis、Scianna、Kell、Colton、Yt和Lutheran血型系統呈單態性分布；Kell、Colton、Yt血型系統中，罕見表型Kpa+b+、Coa+b+、Doa+b+、Yta+b+中，少數民族均高于漢族（表4），且漢族中未發現Coa+b+（χ2=7.572，P=0.023）和Yta+b+（χ2=7.709，P=0.021）兩種表型，經過χ2值運算這幾種表型均為P<0.05，有統計學意義。

甘肅省臨夏回族自治州積石山保安族東鄉族撒拉族自治縣是甘肅省唯一的多民族自治縣，居住環境相對隔離，民族間有各自獨立的宗教信仰與通婚習俗，具有自身的遺傳特征，特別是少數民族中罕見表型Kpa+b+、Coa+b+、Doa+b+、Yta+b+占比均高于漢族，說明漢族血型基因有著高度集中性，更接近于亞裔黃種人基因分布特征，因而血型系統基因遺傳相對穩定[5-7]，其與國內的其他地區少數民族相比較也存在差異，因此不同地區、民族和人群中存在著一定的相同性和差異性[8-13]。這對人類遺傳學的研究具有重要的意義。

人類紅細胞血型的表型和基因型在遺傳學上存在個體差異，各民族之間也有一定的差異性，由于血型分布與人種以及種族群體相關，此次研究對于甘肅省少數民族地區人群紅細胞血型遺傳背景及甘肅省稀有血型數據庫的建設提供依據不同的血型抗原具有遺傳多態性，不同民族或地區間具有一定的差異性。[14]輸血可以挽救患者生命，但輸血治療引起的同種異體免疫反應也會威脅患者的生命安全。[8]在患者隨機輸血或妊娠免疫刺激時，一些稀有血型抗原不一定完全匹配，可能會從產生抗體，導致輸血不良反應，新生兒溶血病和免疫性疾病。[11]精準醫學的基本概念是考慮到個體差異后所實施的預防診斷和治療策略，對有輸血史、妊娠、組織器官移植等同種免疫作用產生血型抗體患者的輸血（如常見的有抗E、抗C/c、抗EC、抗S/s、抗M/N、抗K、抗Mur、抗Fy等），甚至還發現由抗-Fy、抗k，抗C聯合抗體[15-17]，給輸血帶來極困擾，需要個體化處理，輸注相應抗原陰性的血液[14]。因此，調查地區性人群多種紅細胞血型系統基因頻率分布特點，建血型基因型數據庫[18]，為患者提供與大多數免疫性抗原相容的血液成分，對稀有血型患者選擇配合型血液輸注、指導臨床科學合理用血、提高血液資源有效利用，及預防新生兒溶血具有重要意義，且能達到精準輸血的目的[19]。

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