發酵藍靛果果汁酵母菌的篩選及香氣成分分析

韓春然，畢海鑫，王鑫

（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150028）

藍靛果（Lonicera caerulea L.var.edulis）是一種忍冬科忍冬屬，富含豐富營養物質的漿果類植物[1]。風味獨特，但口感酸澀，通常直接食用不宜被大眾接受[2]，因此對藍靛果深加工技術的研究能有效提高其經濟價值。一株活力旺盛的酵母菌在自身代謝的同時還能產生糖類、多肽等多種功能性物質，利于果汁品質的改善并產生濃郁的香氣[3]。目前，關于藍靛果制品的報道已有藍靛果酸奶、果酒、果醬等[4]，但國內外對酵母菌發酵藍靛果果汁菌種的篩選及其芳香物質的分析卻報道較少。由于藍靛果的主要澀味來源是單寧，與人口腔內唾液蛋白黏膜反應可引起收斂感，單寧酶作為發酵產生的誘導酶，是降解單寧的關鍵性限制酶[5]，酶活力越高，越有利于改善果汁品質。此外，果汁的主要呈香物質酯類也是影響果汁風味的關鍵指標。因此，尋找一株單寧酶活力旺盛且產酯能力高的酵母菌應用于藍靛果果汁的發酵具有重要意義。本研究從3種果酒酵母中篩選出一株單寧酶活力、產酯能力優良的酵母菌，綜合色度、理化指標及感官評價進一步驗證其發酵特性，并對3種酵母菌發酵藍靛果果汁進行香氣成分分析，為藍靛果產品的研發奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍靛果：產自七臺河市勃利縣；LA-DE、LA-EC、LA-FR果酒酵母：煙臺帝伯仕自釀機有限公司；麥芽浸粉（生物試劑）：北京奧博星生物技術有限公司；沒食子酸（分析標準品）：天津市光復精細化工研究所；沒食子酸丙酯（分析純）：哈爾濱市新春化工廠；檸檬酸、檸檬酸鈉（均為分析純）：天津市博迪化工股份有限公司；甲醇（分析純）：山東禹王和天下新材料有限公司；繞丹寧（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；其它試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

榨汁機（L18-Y926）：九陽股份有限公司；恒溫搖床培養箱（ZHWY-2102C）：上海智城分析儀器制造有限公司；高壓蒸汽滅菌器（YX280）：上海三申醫療器械有限公司；超凈臺（HD-920）：北京東聯哈爾儀器有限公司；離心機（TD5A）：湖南凱達科學儀器有限公司；紫外可見分光光度計（UV-5200）：上海元析儀器有限公司；氣相色譜-質譜聯用儀（6890-5973型）：美國安捷倫公司；數顯pH計（HWS-26）：上海一恒科學儀器有限公司；酒精計（0～30 mL）：武強縣威爾儀表廠；色差儀（CR-400）：日本Konica Minolta公司。

1.3 方法

1.3.1 藍靛果果汁樣品的制備

藍靛果解凍，去除采摘殘留的果枝、果葉，挑選成熟度適宜、完整無損壞的果實清洗后于榨汁機攪拌打漿，使果實充分破碎。將勻漿用4層紗布過濾除雜，121℃滅菌20 min，冷卻后接種發酵，發酵完成于4 000 r/min離心5 min，得到藍靛果果汁，備用。

1.3.2 菌種活化與培養液制備

用接種針分別挑取少量3種酵母菌于5%麥芽浸汁培養基（121℃、20 min滅菌）中活化（36℃左右），按照3種酵母菌的最適生長溫度，分別于恒溫搖床培養箱培養48 h后，再分別接種于新鮮的5%麥芽浸汁培養基中，于最適生長溫度培養48 h。將傳代2次的菌液作為純培養液（活化后的菌液濃度為107CFU/mL）。

1.3.3 酵母菌生長曲線的測定

無菌操作條件下，取216支試管，分成3組（每組72支試管），分別標記為DE、EC和FR組。各試管均分裝5%麥芽浸汁培養基10 mL，121℃滅菌20 min，冷卻后，將活化的酵母菌純培養液按1%接種量接入各試管，搖勻后于3種酵母菌最適生長溫度的恒溫搖床培養箱中培養，每隔4 h取各組酵母菌培養液5 mL，稀釋10倍，在560 nm下測定吸光值（OD值），以空白培養基為對照，觀察3種酵母菌培養72 h的生長情況，每個試驗平行3次，取平均值，根據OD值繪制酵母菌生長曲線。

1.3.4 單寧酶活力的測定

1.3.4.1 粗酶液提取

參考馬如意[6]的方法略有改動。酵母菌發酵液4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，收集菌體。按緩沖液∶發酵液=1∶1（體積比）加入 pH 5.0 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，菌懸液即為粗酶液。

1.3.4.2 酶活力測定

依據沒食子酸與甲醇-繞丹寧反應產生色團物質測定單寧酶活力[7]。依次將3支試管標記為對照、測試和空白。分別將沒食子酸丙酯及粗酶液于40℃水浴中預熱5 min～10 min。各試管均加入沒食子酸丙酯溶液0.25 mL，空白管加pH 5.0緩沖液0.25 mL，測試管加粗酶液0.25 mL，對照管不加物質，3支試管40℃水浴5 min后均加入0.05 mo/L甲醇-繞丹寧0.3 mL，40℃水浴5 min，僅在對照管加粗酶液0.25 mL，再往各試管加入0.5 mol/L KOH溶液0.4 mL，40℃水浴5 min，最后取8 mL蒸餾水加入3支試管，于520 nm波長下測定反應混合物的吸光值，以蒸餾水為空白。以沒食子酸標準溶液（40 μmol/L～260 μmol/L）作標準曲線。

上述條件下，每分鐘沒食子酸丙酯被單位體積粗酶液水解生成1 μmol沒食子酸消耗的酶量為一個酶活力單位。酶活計算公式如下。

1.3.5 產酯能力的測定

利用皂化反應測定總酯含量[8]。于250 mL回流瓶中加入50 mL果汁樣品，加2滴酚酞指示劑，用0.1 mol/L NaOH標準滴定溶液滴定至粉紅色為止，記錄消耗NaOH標準滴定溶液的體積，再加入NaOH標準滴定溶液25 mL并放2顆～3顆沸石，于沸水浴冷凝回流30 min，冷卻后，用0.1 mol/L H2SO4標準滴定溶液滴至微紅色消失即可，記錄H2SO4標準滴定溶液的消耗量。用40%無酯乙醇溶液做空白，操作同上。總酯含量計算公式如下。

式中：X為樣品總酯的質量濃度（以乙酸乙酯計），g/L；c 為 H2SO4標準滴定溶液濃度，mol/L；V0為空白試樣消耗H2SO4標準滴定溶液的體積，mL；V1為樣品消耗H2SO4標準滴定溶液的體積，mL；88為乙酸乙酯摩爾質量，g/mol；50 為樣品量，mL。

1.3.6 色度的測定

采用色差儀測定果汁樣品的色度，L*明暗度（0

1.3.7 發酵果汁理化指標測定

總酸、殘糖參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[9]測定；酒精度采用酒精計測定；pH值采用pH計測定。

1.3.8 揮發性香氣成分的測定

1.2 方法 采集肘靜脈血2 ml冷凍保存，統一送檢，用于血常規的檢測，項目包括細胞計數、血紅蛋白(Hb)含量、紅細胞壓積、紅細胞平均體積、紅細胞平均Hb含量及紅細胞平均Hb濃度。經過查閱文獻、專題討論、專家評閱等過程設計統一的問卷調查表，主要內容包括兒童性別、年齡、出生體質量、喂養的方式、消化功能、輔食添加時間、妊娠期貧血情況、父母親的文化程度、家庭飲食習慣、鐵制劑服用情況、家庭收入、居住地等。

1.3.8.1 樣品萃取條件

取30 mL果汁樣品于40 mL進樣瓶中，加入2 g氯化鈉，60℃水浴平衡15 min，將老化好的DVB/CAR/PDMS提針插入進樣瓶（老化時間5 min），使進樣瓶的頂空氣體觸碰到石英纖維頭，60℃恒溫萃取40 min，將纖維頭用手柄推回針頭后拔出，插入氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用進樣器，在250℃下解析1 min，同時開始采集數據。

1.3.8.2 色譜條件

色譜柱為 DB-5（60 m×0.25 mm，0.25 μm），采用程序升溫：從室溫（21℃）升到100℃保持5 min，再以5℃/min的速度升到250℃，保持5 min，無分流進樣。進樣口溫度為250℃，載氣氦氣的流量為1.0 mL/min。

1.3.8.3 質譜條件

225℃時進行MS離子源全掃描，電離方式：電子電離（electron Ionization，EI），電子能量 70 eV；掃描質量范圍：50 amu～500 amu。

1.3.9 感官評價

評價小組由10人組成，從香氣、口味、外觀3個方面，共9項指標對果汁進行感官評價。每項指標為0～10分，分數由高到低表示各指標的強弱程度，小組平均分為最終得分，評價指標及說明見表1。

表1 發酵藍靛果果汁感官評價指標及說明Table 1 Indexes for sensory evaluation of fermented Lonicera edulis fruit juice

1.4 數據處理

利用Excel 2019軟件對試驗數據統計整理后通過Origin 8.5軟件作圖，利用IBM SPSS Statistics 24軟件進行顯著性分析（p<0.05），將分離得到的揮發性組分對應質譜檢索分析，采用峰面積歸一化法定量。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的生長曲線

酵母菌的生長曲線見圖1。

圖1 3種酵母菌的生長曲線Fig.1 Growth curves of three different yeast strains

由圖1可知，3種酵母菌生長趨勢大體一致，從OD值變化可知，3種酵母菌的遲滯期均為接種后的0～4 h，32 h后進入衰亡期。不同酵母菌在遲滯期內的活性不同，LA-DE在遲滯期內的活性最高，對數生長期為4 h～20 h，發酵20 h后吸光度達到最高并趨于穩定，進入穩定期。LA-EC與LA-FR的生長趨勢相似，對數生長期為4 h～24 h，穩定期為24 h～32 h，二者均于28 h時達到最高吸光度。與LA-EC、LA-FR相比，LADE到達穩定期的時間最短、穩定期最長，發酵過程平穩，經以上分析初步判斷，酵母菌LA-DE具有優良的發酵潛質。

2.2 單寧酶活力的變化

單寧酶活力的測定首先進行標準曲線的繪制。本研究以沒食子酸作為標準參照，標準曲線見圖2。

圖2 沒食子酸標準曲線Fig.2 Standard curve for gallic acid

單寧酶可以催化單寧及沒食子酸酯類的酯鍵、縮酚鍵生成沒食子酸、葡萄糖及其他化合物[10]。以液體培養基為原料進行酶活力測定有利于控制發酵條件，降低雜菌的污染幾率，可隨時監測酶活力。3種酵母菌單寧酶活力比較見圖3。

圖3 3種酵母菌單寧酶活力的比較Fig.3 Comparison of tanninase activity of different yeast strains

由圖3可知，3種酵母菌于藍靛果果汁培養液的單寧酶活力均高于麥芽浸汁培養液。這可能是由于在相同條件下，不同培養液中酵母菌產酶的誘導物不同[11]，導致單寧酶的表達情況不同，因此酶活力也有所差異，LA-DE于麥芽浸汁培養液和藍靛果汁發酵液中的酶活力分別達到3.99 U/mL和8.23 U/mL，顯著高于其它兩種酵母菌（p<0.05），說明LA-DE產酶水平較高，穩定性較好。蔡淑娟等[12]在產單寧酶酵母菌的篩選研究中，其菌株FC6-1的單寧酶活力為2.86 U/mL，與本試驗存在差異，原因可能是菌株不同，單寧酶活力有所不同，另外，反應體系也有所不同（菌株FC6-1的反應體系為單寧酸液體發酵培養基）。因此，單寧酶活力受菌株和底物影響較大。

2.3 產酯能力的變化

3種酵母菌產酯能力見圖4。

圖4 3種酵母菌產酯能力的比較Fig.4 Comparison of ester production capacity of different yeast strains

由圖4可知，3種酵母菌于藍靛果果汁培養液的產酯效果均顯著（p<0.05）高于麥芽浸汁培養液。這可能是由于酵母菌對麥芽浸汁培養液中營養元素的利用率較低，從而菌株的生長發酵在一定程度上受到抑制，產酯能力也有所降低，說明酵母菌發酵有利于增加藍靛果果汁風味物質。藍靛果果汁培養液中，LADE的產酯能力最為突出，其總酯含量達到4.07 g/L，高于LA-EC和LA-FR產生的總酯含量。李棒等[13]在高酸度水果果酒優良產酯酵母菌株的鑒定中得到的菌株E3（Wickerhamomyces anomalus）的產總酯能力最高能達到3.91 g/L，與本研究結果接近。

2.4 色度分析

有研究指出，酵母細胞壁對色素分子具有吸附作用，且酵母菌能夠與果汁中顏色物質反應[14]，因此酵母菌的種類對果汁色澤有直接影響。3種酵母菌發酵藍靛果果汁的色度指標見表2。

表2 酵母菌發酵藍靛果果汁色度分析Table 2 Colority of Lonicera edulis fruit juice fermented by different yeast strains

由表2可知，LA-DE發酵藍靛果果汁的L*顯著高于其余兩組（p<0.05），這可能是因為色素變化使果汁的褐變程度較小，亮度值較高。LA-EC與LA-DE發酵果汁的a*顯著高于LA-FR（p＜0.05），這是由于發酵使得藍靛果果汁酸度值增加，整體呈趨偏紅勢，果汁顏色最終為紫紅色。3種果汁樣品的b*之間無顯著差異（p＞0.05），可能與多酚類物質有關，酵母菌發酵促進了多酚類物質的釋放和聚合色素的產生，聚合產物和褐變反應賦予了果汁黃色色調[15]。

2.5 理化指標分析

酵母菌發酵藍靛果果汁的各項指標結果見圖5。

圖5 酵母菌發酵藍靛果果汁理化指標分析Fig.5 Analysis of physical and chemical indexes of Lonicera edulis fruit juice fermented by yeast strains

不同酵母菌利用糖類物質代謝產酸的能力不同，部分酸類物質在發酵過程中作為中間代謝產物轉化為其他物質（如酯類）的能力也不同[16]。如圖5所示，對比分析3個果汁樣品，LA-FR的總酸含量低于其他兩種酵母菌，為11.50 g/L。可能是因為LA-FR分解代謝速率遲緩，酸類物質發酵不完全。殘糖量為4.6 g/L～6.0 g/L，LA-DE的殘糖量最低，說明LA-DE對糖的代謝轉化率高，發酵能力較強，發酵過程平穩。LA-DE、LA-EC、LA-FR3種酵母菌發酵果汁的酒精度分別為2.5、1.6、0.9% vol，由于酵母菌以糖類為底物發酵產生酒精[17]，所以酒精度的不同會受到酵母對果汁中碳水化合物的利用率所影響。而pH值則是影響酶活性、酵母新陳代謝的重要因素，3種果汁中LA-FR發酵果汁的pH值最高，達到3.28，這一結果與其酸性含量一致，說明該果汁中酵母的發酵不夠理想。

2.6 感官評價

酵母菌發酵藍靛果果汁的感官雷達圖如圖6。

圖6 酵母菌發酵藍靛果果汁感官評價雷達圖Fig.6 Radar chart of sensory evaluation of Lonicera edulis fruit juice fermented by different yeast strains

由圖6可知，LA-DE酵母菌發酵果汁總體感官評分最高，為9.7分，果香味突出，口感柔和無收斂感，果汁呈紫紅色且色澤明亮，產酸能力最強，產香增鮮的能力突出，有淡淡的藍靛果香及醇厚的發酵香，這是因為LA-DE產總酯能力及單寧酶活力較高，發酵性能及穩定性較好；其次是LA-EC發酵果汁，總體評價得分8.5分，酸甜適中，澄清度最佳，略有澀味和后味；LA-FR發酵果汁得分最低，由于其產酸能力弱且a*值相對較低，總體風味寡淡呈淡紫色，發酵香及果味微弱，略有后味殘存于喉嚨，可見少量沉淀。3種果汁均無特殊異味，說明酵母菌發酵對藍靛果果汁品質有一定增強作用。

2.7 揮發性香氣分析

通過GC-MS對3種酵母菌發酵藍靛果果汁的香氣成分鑒定結果如表3所示。

表3 發酵藍靛果果汁揮發性香氣成分及相對含量Table 3 Volatile aroma components and relative content in fermented Lonicera edulis fruit juice

續表3 發酵藍靛果果汁揮發性香氣成分及相對含量Continue table 3 Volatile aroma components and relative content in fermented Lonicera edulis fruit juice

由表3可知，LA-DE共檢測出香氣組分41種，LA-EC和LA-FR分別檢測出香氣組分25種和27種，3種果汁共有香氣物質為17種，主要組分均為酯類。馮雋野等[18]對發酵藍靛果漿和果汁中種揮發性成分的研究中發現主要揮發組分均是酯類，與本研究結果相似。

2.7.1 酯類物質分析

酯類可賦予果汁特殊的花果香，3種酵母菌中LADE發酵果汁酯類較豐富為20種，癸酸乙酯和辛酸乙酯為3種果汁共有酯類，相對含量均較高，呈甜香、葡萄香和白蘭地香。其它低含量酯類也能輔助果汁呈香，如己酸乙酯賦予果汁曲香和菠蘿香。楊旭等[19]對果汁和帶渣兩種方式發酵“蓓蕾”藍靛果酒中香氣分析發現，主要酯類為辛酸乙酯和癸酸乙酯，癸酸乙酯是發酵藍靛果的典型香氣物質，與本文發酵藍靛果果汁的研究結果一致。

2.7.2 醇類物質分析

果汁中的醇類可能來源于兩方面，一是通過酯類和糖苷類前體分解獲得，二是酵母菌的發酵代謝產生[20]。3種果汁中均檢測出苯乙醇和正戊醇，其中苯乙醇是影響果汁香氣的最主要醇類，具有獨特的玫瑰香，有一定的殺菌作用。周雪艷等[21]也發現影響鴨梨酒揮發性成分的主要醇類為苯乙醇，賦予梨酒特殊的香氣。

2.7.3 酸類物質分析

酸類在發酵藍靛果果汁中具有協調和平衡作用，酵母菌在發酵過程中繁殖代謝產酸[22]。LA-EC發酵果汁中酸類占總香氣的8.36%，LA-DE的酸類組分占比為23.80%，LA-FR的酸類物質占總峰面積的14.64%，對果汁品質有積極貢獻的有機酸均為辛酸和正癸酸，賦予果汁桃子味、草莓味和奶酪味等多種風味。

2.7.4 烷烴類、酚類、醛酮類物質分析

3種果汁中共檢測出烷烴類7種、酚類2種、醛酮類物質3種，其中LA-FR中未檢測出酚類及醛酮類物質。LA-DE發酵果汁中含量較高的苯甲醛賦予果汁怡人的堅果香；其酚類占香氣組分比例最小，4-乙基苯酚相對含量最多，香氣甜潤。楊華等[23]在紅豆越橘果汁中檢測共41種香氣成分，對果汁香型貢獻最大是醇類和酯類，其次是酸類，還有少量烷烴類、烯類、醛酮類及酚類，這些組分共同影響果汁的整體風味結構。與本文的研究結果相似。

3 結論

通過測定LA-DE、LA-EC、LA-FR3種酵母菌的生長曲線，比較分析3種酵母菌發酵藍靛果果汁時的單寧酶活力和產酯能力，初步確定LA-DE酵母菌具有較好的發酵潛質。綜合色度、理化指標及感官評價考察了3種酵母菌的發酵性能。結果表明，LA-DE發酵果汁具有濃郁的果香及發酵香，無收斂感，色澤穩定呈明亮的紫紅色，酒精度為2.5% vol。采用GC-MS對3種酵母菌發酵藍靛果果汁進行香氣成分分析，LADE發酵果汁檢測出香氣組分41種，LA-EC和LA-FR分別檢測出香氣組分25種和27種，包括酯類、醇類、酸類及少量烷烴類、酚類和醛酮類。綜合分析選擇LA-DE作為發酵藍靛果果汁的最優酵母菌，其主體香氣成分為癸酸乙酯、苯乙醇和辛酸，各種香氣組分相互協調，共同賦予發酵藍靛果果汁特征性風味。