淺析PCR擴增產物中目標片段的計算方法

王梅霞

摘要PCR技術作為一項熱門的技術在生命科學研究中的應用廣泛，也是高考評價體系中考查載體的重要來源，但對于高中生而言該部分內容抽象難懂，就PCR產物中目標片段的計算的方法與規律進行了探討。

關鍵詞 PCR技術 DNA復制 目標片段計算

中圖分類號G633. 91文獻標志碼B

《普通高中生物學課程標準（2017年版2020年修訂）》提出：幫助學生達成對“基因工程賦予生物新的遺傳特性”這一大概念的理解，促進學生生物學學科核心素養的提升，應開展利用聚合酶鏈式反應（PCR）擴增DNA片段并完成電泳鑒定，或運用軟件進行虛擬PCR實驗。縱觀歷年高考試題，基因工程相關知識幾乎每年必考。尤其是可以用于獲取目的基因的PCR技術幾乎逢考必出，且考查角度多變、難度與深度都有逐年加大的趨勢。由于PCR擴增DNA的技術要求較高，一般中學很少具備實施該實驗的條件，因此這部分抽象的內容對中學生而言比較深奧，甚至晦澀難懂。學生在考試中遇到PCR相關的題目時，往往會束手無策，甚至會出現棄題不做的現象。下面就PCR產物中目標片段的計算進行探討，希望能對學生學習該部分知識有所幫助。

1例題

【例1】（2011·江蘇卷）33請回答基因工程方面的有關問題：

利用PCR技術擴增目的基因，其原理與細胞內DNA復制類似（圖1）。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎。

①從理論上推測，第四輪循環產物中含有引物A的DNA片段所占的比例為。

②在第輪循環產物中開始出現兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段。

參考答案：①15/16②三

2解題方法

2.1常規解法——繪圖法

使用繪圖法解題如圖2所示。

該方法雖然比較直觀，但是比較耗時費力，倘若考查力度稍加深入，如“經過5個循環后兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段即目標片段的數量是多少”，利用繪圖的方法解決起來就相當困難。

2.2優化解法

（1）數字組合法。

利用數字組合法解題如圖3所示。

由圖3可以看出，PCR過程中的模板鏈共有6種類型。每一輪循環只要理清每種類型的模板鏈的數目，即可推導出產物DNA的類型及數目。例如，第一輪循環模板鏈為①、②各一條，產生的DNA為：①+③；②+④（寫在前面的數字代表模板鏈的類型，后面的數字代表產物鏈的類型）。則第二輪循環的模板鏈為①、②、③、④共4條鏈，產生的DNA為①+③、②+④、③+⑤、④+⑥各一個；易推出第三輪循環的模板鏈為①1、②1、③2、④2、⑤1、⑥1（右下角的數字代表該模板鏈的數目，如③2表示③模板鏈有2條），則產物為[①+③]1、[②+④]1、[③+⑤]2、[④+⑥]2、[⑤+⑥]1、[⑥+⑤]1（[④+⑥]2表示以④為模板合成⑥，兩條鏈組成一個DNA分子，這種DNA分子在該循環中共2個）。那么，第三輪循環出現的⑤+⑥、⑥+⑤型DNA分子即為目標片段。還可以進一步推出第四輪的產物為：[①+③]1、[②+④]1、[③+⑤]3、[④+⑥]3、[⑤+⑥]4、[⑥+⑤]4，其中目標片段為8個。

（2）單鏈算法。

首先將PCR中出現的各單鏈用符號代替：Z代表最初的模板鏈；Ⅰ代表第一輪循環產生的兩種子鏈（一端序列和目標片段不一致的單鏈）；Ⅱ代表目標單鏈。如圖4所示。

那么，在擴增中，最初的模板：Z型單鏈2個。最終的目標為：Ⅱ-Ⅱ型DNA分子。擴增時，由Z模板得到Z-Ⅰ型DNA，由Ⅰ型模板得到Ⅰ-Ⅱ型DNA，由Ⅱ型模板得到Ⅱ-ⅡDNA。經n次循環，得到Z型單鏈2個，Ⅰ型單鏈2n個，其余為Ⅱ型單鏈。結合成的雙鏈為：Z只與Ⅰ結合，余下的Ⅰ全部與Ⅱ結合（本質是雙鏈互補形成DNA分子），得到2個Z-Ⅰ型DNA，2n-2個Ⅰ-Ⅱ型DNA，2n-[（2n-2）+2]個Ⅱ-Ⅱ型DNA，最終得到目標雙鏈Ⅱ-Ⅱ共2n-2n個。

利用單鏈算法解例1，可以得出當n=1或2時，2n-2n=0，當n=3時，目標片段為23-2×3=2個，即第三輪循環才出現2個兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段。

3拓展延伸

PCR技術也常常用于基因的定點誘變，通常將突變序列設計在人工合成的引物中，利用這種引物進行PCR擴增即可得到突變基因，當引物中含有突變位點時，經過幾輪循環可以得到目標片段呢？經過若干循環后，目標片段的含量如何計算呢？

【例2】環狀質粒PCR誘變法是一種十分簡便的定點誘變技術，可用于基因工程和蛋白質工程，現以定點誘變質粒pUC18為例介紹該誘變方法。質粒pUC18上限制酶Eaml1105I的識別序列在氨芐青霉素抗性基因內部，為防止氨芐青霉素抗性基因的破壞，選擇限制酶Eaml1105I的識別序列中的某堿基為誘變位點，并創設PCR體系進行擴增，所用引物和實驗流程如圖5所示。設定PCR的循環次數為30次，得到的初產物①主要是與質粒pUC18等長的線性DNA分子；若體系中初始質粒數為a，則終產物中含突變堿基對的DNA分子數為。

分析：（1）利用繪圖方法來解決該問題比較困難，可以采用繪圖和數字組合相結合的方法。首先繪出第一、第二輪的擴增產物示意圖，以明確模板鏈的類型。如圖6所示。

（2）利用單鏈算法解題。

最初的模板鏈為1、2兩條。最終的目標為4+5雙鏈DNA分子。擴增時：1→1+3、2→2+4、3→3+4 4→4+5、5→5+4。經n次循環，得單鏈：1，2，n個3，其余為4和5。結合成的雙鏈，1只與3結合，2只與4結合，余下的3全部與4結合（本質是兩條鏈互補配對形成一個DNA分子），得到：1個1+3、1個2+4、n-1個3+4，則目標片段為2n-（n-1）-1-1即2n-（n+1）。

4結束語

PCR相關的計算本質上是考核DNA分子的復制特點：半保留復制。在教學中，教師要引導學生掌握細胞內DNA復制的相關內容，注重二者之間的聯系與區別。教師引導學生在平時備考中遇到相關的問題進行思維訓練和方法總結，這樣學生就能順利解決PCR技術中的計算題。