基于HPLC 法測定王不留行不同炮制品中主成分含量

黃檢平，周鳴，陳秀娟，李晶，高慧，葉喜德

1.上高縣中醫院，江西 上高 336400；2.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004；3.福州市長樂區婦幼保健院，福建 福州 350200

王不留行為石竹科植物麥藍菜［Vaccaria segetalis（Neck.）Garcke］的干燥成熟種子，在夏季果實成熟、果皮尚未開裂時采收［1］。其味苦性平，主入肝胃經，具活血通絡、下乳消腫、利尿祛濕之功［2］。臨床常以復方入藥以治療女性閉經、痛經、母乳不降、乳房膿腫腫痛、淋證澀痛等證［3-5］。主含黃酮類、生物堿、三萜皂苷、環肽、多糖和揮發油等成分，其中王不留行黃酮苷（vaccarin）和刺桐堿（hypaphorine）是其主要有效成分。前者具有促進乳汁分泌、血管新生、內皮細胞增殖，改善內皮損傷、肝臟糖脂代謝紊亂，抑制高血糖、高血壓、高血脂等藥理作用［6］。而刺桐堿具抗炎、增強免疫和抗肝損傷等作用［7］。歷代醫學典籍記載，王不留行炮制方法較多，如制炭、清蒸、酒蒸和清炒等［8］。目前《中國藥典》2020 版只保留了生品和清炒品兩種規格，而其他古法炮制多已不用且研究較少。在炒制法中，王不留行除清炒外，現衍化出其他許多不同炮制方法，如潤炒法、酒炒法、油砂炒法等［9］。在對其炮制工藝研究時，王不留行中的刺桐堿和王不留行黃酮苷常作為其重要的質量評價指標［10］。由于中藥在臨床應用前必須進行炮制，而不同炮制方法涉及的因素各異，從而對藥材化學成分產生不同的影響，進而影響藥效。基于此，本研究基于HPLC法測定王不留行不同炮制品中刺桐堿和王不留行黃酮苷的含量，以比較不同炮制方法對王不留行主要有效成分含量變化的影響，為深入研究提供參考。

1 試驗材料

1.1 儀器設備

Agilent 1100 高效液相色譜儀（安捷倫儀器有限公司）；FA1004N 萬分之一電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；YF-111B 高速中藥粉碎機（瑞安市永歷制藥機械有限公司）；十萬分之一分析天平ESJ180-4，沈陽龍騰電子有限公司；KQ-500E 超聲波清洗器（120 W，40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司）；TDL-80-2C 低速離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 藥材

王不留行藥材購自安徽匯仁堂中藥飲片有限公司，經江西中醫藥大學龔千峰教授鑒定為石竹科植物麥藍菜的干燥成熟種子。

1.3 試劑

王不留行黃酮苷對照品（四川省維克奇生物有限公司，批號：wkq20060206，質量分數≥98%）；刺桐堿對照品（四川省維克奇生物有限公司，批號：wkq20070902，質量分數≥98%）；甲醇、乙腈為色譜純，水為雙蒸水，江西中醫藥大學大型精密儀器共享服務中心（簡稱大儀中心）制備。

2 方法與結果

2.1 王不留行炮制品的制備

2.1.1 生品 取100 g 王不留行藥材，篩去雜質后洗凈曬干。用塑料封口袋密封保存，做好標簽，備用。

2.1.2 清炒品 取王不留行藥材100 g，篩去雜質后洗凈曬干，確保其充分干燥。用中火把鍋預熱，投入少許王不留行，王不留行入鍋即爆花后，投入剩余藥材，用小竹帚同方向連續炒制大部分爆白花，出鍋，放涼。用塑料封口袋密封保存，做好標簽，備用。

2.1.3 潤炒品［11］取王不留行藥材100 g，篩去雜質后洗凈曬干，使其充分干燥。干燥后用10 g 左右的水浸潤，浸潤15 min 左右。用中火把鍋預熱后，投入少許王不留行試藥，待王不留行一入鍋就爆花后，倒入剩余王不留行，用小竹帚同方向連續炒制大部分爆白花，取出晾涼，用塑料封口袋密封保存，做好標簽，備用。

2.1.4 酒炒品 取王不留行藥材100 g，篩去雜質，洗凈曬干，確保其充分干燥。充分干燥后加入10 g左右的黃酒拌勻，浸潤15 min 左右，同上用中火預熱鍋和試藥后，倒入王不留行，用小竹帚同方向連續炒制大部分爆白花，出鍋，放涼，用塑料封口袋密封保存，做好標簽，備用。

2.1.5 油制品［12］取2 號篩至3 號篩之間的中粗砂，篩去石子，洗凈，晾干，放入鍋中加熱，加入食用油約10 g，用武火翻炒至油完全散開，待砂色均勻、深沉后取出，冷卻備用。將篩去雜質并洗凈的王不留行充分干燥，用中武火把鍋預熱，把200 g 左右的砂子投入鍋內翻炒至砂子處于滑利狀態。投入少許王不留行試藥，王不留行入鍋即爆花后，投入100 g 藥材，用小竹帚同方向連續炒制大多數爆成白花時，出鍋，放涼，篩砂。用塑料封口袋密封保存，做好標簽，備用。

將制備好的5 種王不留行炮制品粉碎成粉末，通過3 號篩，裝袋并做標記。各炮制品中輔料和藥物的比例見表1。

表1 不同炮制方法參數（g/100g）

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件色譜柱 Tnature C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1% 甲酸水（B），梯度洗脫（0～10 min，13% A；10～20 min，13%→20% A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；進樣量:5 μL。各溶液色譜圖見圖1。

圖1 各待測液HPLC色譜圖：A.刺桐堿、王不留行黃酮苷混合對照品；B.生品；C.清炒品；D.潤炒品；E.酒炒品；F.油制品

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取刺桐堿對照品、王不留行黃酮苷對照品，分別加色譜級甲醇制成濃度為1.13 mg/mL、1.02 mg/mL 的對照品溶液的刺桐堿和王不留行黃酮苷母液。從母液中吸取刺桐堿50 μL、王不留行黃酮苷225 μL 至同一樣品瓶中，再吸取725 μL 色譜級甲醇至樣品瓶中，混合均勻，配成每1 mL 含刺桐堿56.5 μg、王不留行黃酮苷229.5 μg的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取王不留行不同炮制品粉末1.0 g，精密稱定，裝入15 mL 的EP 管中，首次提取加入5.5 mL 50%甲醇水溶液，Vortexfor 混旋至粉末完全溶于甲醇水溶液中且混合均勻（即EP 管底部不殘留粉末）。然后在常溫下超聲提取30 min，取出放至溫室，3 000 rpm 離心10 min，傾取上清液，放入10 mL 容量瓶中。重復以上步驟，連續反復提取3 次（第2、3 次添加溶劑量約3.5 mL），合并3 次提取液，定容至10 mL。提取液先經0.45 μL 的微孔濾膜過濾，去除1 mL 后，用5 mL 的一次性注射器注入到10 mL 樣品瓶中，留樣備用。再從該樣品瓶中用1 mL 的一次性注射器吸取1 mL 的提取液，經0.22 μL 微孔濾膜過濾，去除前面2 滴后，注入到樣品瓶，即為供試品。將已經制備好的樣品冷藏保存。

2.2.4 標準曲線制備 精密吸取混合對照品溶液2、4、6、8、10、12、14 μL，按“2.2.1”項下色譜條件測定，以峰面積為縱坐標（Y），對照品進樣量為橫坐標（X），繪制標準曲線，結果見表2。

表2 刺桐堿、王不留行黃酮苷標準曲線

2.2.5 精密度試驗 吸取“2.2.2”項下刺桐堿、王不留行黃酮苷對照品母液各100 μL 至樣品瓶（內置內插管），充分混勻，制成混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，進樣量5 μL，連續進樣6 次，記錄各成分峰面積，計算得到刺桐堿、王不留行黃酮苷峰面積的RSD 分別為1.18%，1.25%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于配制后0、3、6、9、12、24 h，按“2.2.1”項下色譜條件進樣5 μL，計算得到刺桐堿、王不留行黃酮苷峰面積的RSD 分別為2.04%，1.43%，表明供試品在24 h 內穩定性良好。

2.2.7 重復性試驗 按“2.2.3”項方法平行制備王不留行供試品溶液6 份。按“2.2.1”項下色譜條件進樣5 μL，計算得到刺桐堿、王不留行黃酮苷峰面積的RSD 分別為1.72%，1.60%，表明方法重復性良好。

2.2.8 樣品含量測定 分別稱取1.0 g 王不留行5 種炮制品粉末，按“2.2.3”的方法配制供試品溶液，按“2.2.1”的色譜條件測定其中刺桐堿和王不留行黃酮苷的含量。結果見表3。

表3 不同炮制品中刺桐堿、王不留行黃酮苷的含量（n=3，mg/g）

3 討論與小結

王不留行主要成份王不留行黃酮苷，含量易受外界環境因素的影響而發生變化，從而影響藥材的質量。該藥材雖有許多不同炮制品，但《中國藥典》主要以清炒品為主。由于清炒法涉及加熱溫度、時間等環節，這些因素勢必會影響王不留行中化學成分含量，進而影響飲片質量。

目前對王不留行的研究，主要集中在對臨床應用和化學成分的研究，而臨床使用的王不留行多以清炒法為主，而砂炒法也逐漸在企業中應用，被認為是王不留行最佳炮制方法［13］。在炮制方面，主要是比較王不留行炮制前后藥效差異，但并未開展其炮制機制研究。因此，課題組選擇不同炮制方法對刺桐堿和王不留行黃酮苷等含量的影響，目的是探討不同炮制方法對王不留行主要有效成分的影響，以確立發生炮制變化的生物標志物。因此，基于HPLC 法測定王不留行不同炮制品中刺桐堿和王不留行黃酮苷的含量差異，為優選王不留行優質飲片提供科學依據。本研究結果表明，刺桐堿和王不留行黃酮苷含量以生品最高，不同炮制品的刺桐堿和王不留行黃酮苷含量存在差異。如表3 所示，炮制對王不留行中刺桐堿的含量影響不大，而對王不留行黃酮苷的影響顯著。相比生品，油制品中王不留行黃酮苷含量顯著下降，刺桐堿的含量亦是下降最多；其他炮制方法比生品也相應降低，其中清炒法下降最少。實驗結果說明，不同炮制方法對王不留行中刺桐堿和王不留行黃酮苷的含量產生影響，這種變化與加熱時間、溫度等方面存在關聯，從而導致生物堿類和黃酮類成分破壞流失［14］。

本試驗比較了不同炮制方法王不留行中刺桐堿、王不留行黃酮苷的含量變化，測定方法穩定，實驗數據可靠，可為其炮制工藝的改進和新工藝的建立提供數據支撐。試驗所用的HPLC 測定中藥含量的方法，重復性高，簡單易行。但縱觀整個實驗，本研究還存在一些不足之處，如王不留行的質量指標選擇較少，未能從多成分、多指標的角度進行深入研究，希望本研究能為王不留行的深入研究提供參考。