葡聚糖硫酸鈉誘導不同性別潰瘍性結腸炎小鼠模型的比較

張琳珮，陸洪艷，史雯雪，蔣霞

廣西醫科大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530021

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）屬于炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）的一種，是一種非特異性腸道炎癥性疾病，其病程長，病情輕重不等，是近年來發病率逐漸升高且難以治愈的疾病之一［1］。基礎研究中建立符合疾病發展特點的動物模型至關重要，在現有的復制UC 動物模型的基礎研究中，探討較多的是實驗動物的種屬、周齡、模型制作方法等［2-5］，但尚未見有討論3%葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）溶液誘導UC動物模型性別差異的研究。本實驗通過給雌性、雄性C57BL/6J 小鼠自由飲用3% DSS 溶液復制UC 動物模型，分析不同性別小鼠UC 模型的疾病活動指數（disease activity index，DAI），病死率，成模率，結腸長度，脾臟系數，結腸病理變化，來探討性別差異對UC 模型的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

葡聚糖硫酸鈉（相對分子質量為35 000～50 000，美國MP），批號：S4140；糞便隱血定性檢測試劑盒（鄰聯甲苯胺法，北京雷根），批號：TC0511；HE 染液套裝（武漢賽維爾），貨號：G1003。

1.2 儀器

L204 電子天平（上海梅特勒托利多）；Milli-Q A10 超純水系統（美國Millipore）；VORTEX GENIUS 3型渦旋振蕩儀（德 國IKA）；Thermo Scientific SL 8R 型高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher）；生物倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯）；脫水機（DIAPATH）；包埋機（武漢俊杰）；病理切片機（上海徠卡）。

1.3 動物

雌性、雄性C57BL/6J 小鼠，SPF 級，6-8 周齡，體質量18～22 g，SPF 級，由廣西醫科大學動物實驗中心提供［實驗室許可證號：SYXK（桂）2020-0004］。

1.4 方法

1.4.1 使用3% DSS 溶液誘導UC 動物模型 健康雌性、雄性C57BL/6J 小鼠24 只，隨機分為雌性對照組、雄性對照組、雌性DSS 組和雄性DSS 組，每組6 只。適應性喂養1 周后，雌性、雄性對照組正常供給飼料、飲水，雌性、雄性DSS 組給予正常飲食+3% DSS 溶液造模自由飲用7 d 進行造模［6］。

1.4.2 檢測指標及方法（1）一般情況及結腸長度測量：每日觀察并記錄小鼠的一般情況：精神狀態、體質量、進食量、毛色光澤、糞便性狀及隱血等。在第8 天用10%水合氯醛腹腔注射麻醉處死小鼠后，解剖小鼠，測量結腸總長度。（2）疾病活動指數（DAI）：自試驗d0 開始，每日固定時間稱量各組小鼠體質量，記錄每只小鼠的糞便性狀，運用糞便隱血定性檢測試劑盒（鄰聯甲苯胺法）檢測糞便隱血情況。體質量的變化以基線體質量下降的百分比表示：體質量變化(%)=［1+(造模后體質量-造模前體質量)/造模前體質量］×100%。按表1 計算DAI 指數評分，DAI=(體質量下降分數+糞便性狀分數+血便分數)/3［7］。（3）脾臟系數：摘取小鼠脾臟，量取脾臟質量，計算脾臟系數。脾臟系數（%）=［脾臟質量（mg）/處死前小鼠體質量（g）］×100%。（4）結腸病理切片觀察—蘇木精-伊紅（HE）染色檢測：剖腹后，剪取距肛門以上2 cm 結腸，剔除腸系膜，取病變最明顯處結腸組織2～3 cm，沿縱軸剪開，用生理鹽水清理腸內容物，放置于4%多聚甲醛中固定，按常規包埋、切片，HE 染色后，在光學顯微鏡下觀察結腸組織病理變化。

表1 DAI評分標準

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 小鼠一般狀況及體質量變化

實驗期間，兩對照組小鼠精神狀態良好、反應靈敏、皮毛光亮，體質量緩慢增長，大便正常。DSS 組小鼠飲用3% DSS 溶液后，兩組小鼠體質量均不同程度下降，蜷縮聚堆，精神萎靡，飲食量減少，拱背，皮毛枯槁無光澤，伴有黏液稀便、肉眼血便等癥狀。小鼠在活動性結腸炎期間通常體重減重10%～20%，根據倫理規則，體質量減輕20%～25%或更多被認為是終止實驗的標準［2］。與雌性對照組比較，雌性DSS 組體質量明顯減少（P＜0.01）；與雄性對照組比較，雄性DSS 組體質量明顯減少（P＜0.01）。與雄性DSS 組比較，雌性DSS 組體質量減少幅度更小（P＜0.01）。見圖1、表2。

圖1 各組小鼠體質量變化

表2 各組小鼠體質量及變化（）

表2 各組小鼠體質量及變化（）

注：與同性別對照組比較，aP＜0.01，不同性別DSS組比較，bP＜0.01。

2.2 小鼠DAI 指數、病死率、成模率結果分析

自由飲用3% DSS 溶液誘導的UC 小鼠模型評價標準之一：造模后小鼠出現精神倦怠、飲食量下降、體質量減少并伴有黏液稀便、血便等癥狀。實驗期間，雌性和雄性DSS 組均出現不同程度的上述癥狀，表明造模成功。雄性DSS 組小鼠d2 開始出現黏液便及松散糞便，d3 開始出現糞便隱血陽性，d4 大部分小鼠出現肉眼血便，DAI 指數顯著升高，在d4、d5 各有1 只死亡，d7 整組小鼠體質量均減少＞25%（體質量減少＞25%應終止實驗）；雌性DSS 組小鼠d4 開始出現黏液便及糞便隱血陽性，d5 有1 只小鼠死亡，部分小鼠出現肉眼血便，DAI指數逐漸升高，癥狀出現時間及程度均明顯比雄性DSS 組輕。雌性和雄性DSS 小鼠DAI 指數均分別顯著高于同性別對照組小鼠（P＜0.05），其中雌性DSS 組DAI 指數較雄性DSS 組低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠的DAI 指數、病死率、成模率分析

2.3 小鼠結腸長度、脾臟系數

在UC 模型實驗中，隨著炎癥的加重，結腸出現縮短的情況［8］。兩對照組小鼠結腸組織均勻光滑，無水腫充血情況，糞便成型，而雌性和雄性DSS組小鼠結腸均出現明顯縮短的情況，結腸充血、腫脹，沒有成型糞便，結腸內可見血色糞便，如圖2示。雌性DSS 組中小鼠的結腸長度與對照組相比，結腸長度減少了23.6%，而雄性DSS 組中小鼠的平均結腸長度與對照組相比減少了31.6%，均差異有統計學意義（P＜0.01）。雌性DSS 組結腸縮短長度明顯低于雄性DSS 組（P＜0.05）。

圖2 各組小鼠結腸組織圖

與對照組比較，雌性和雄性DSS 組脾臟器系數均顯著提高，差異有統計學意義（P＜0.01）；在同性別DSS 組中與雄性對照組比較，雌性DSS 組脾臟器系數增長較少（P＜0.01）。見表4。

表4 3% DSS對小鼠的結腸長度、脾臟器系數的影響（）

表4 3% DSS對小鼠的結腸長度、脾臟器系數的影響（）

注：與同性別對照組比較，aP＜0.01；不同性別DSS組比較，bP＜0.05，cP＜0.01。

2.4 小鼠結腸組織病理學變化

雌性、雄性對照組小鼠結腸黏膜結構完整光滑，未見炎性、壞死的細胞、糜爛及潰瘍等。雌性、雄性DSS 組通過3% DSS 溶液誘導后出現了典型的UC 的病理變化：均可見結腸黏膜上皮細胞大量脫落形成潰瘍，伴大量炎性細胞浸潤，排列紊亂，侵入黏膜下層及肌層，但雌性DSS 組較雄性DSS 組黏膜充血水腫輕，黏膜下層及肌層炎癥細胞浸潤較雄性DSS 組少，可見少量完整杯狀細胞。見圖3。

圖3 3% DSS溶液對UC小鼠結腸組織病理變化的影響（HE，×200）

3 討論

UC 是目前最常見的炎性腸道性疾病，其發病機制、病因尚未完全明確，目前多認為其發病可能由環境、感染、遺傳和免疫等多重因素相互影響［9-10］。UC 模型的建立是基礎研究工作的第一步，建立與人類UC 相似的動物模型有助于開展UC 的機制及治療研究。DSS 是一種帶負電荷的葡萄糖聚合物，對結腸黏膜具有破壞性，可使腸黏膜通透性增加，引發炎癥反應［11］。研究發現由一定濃度的DSS 溶液誘導的UC 動物模型是目前研究UC發病機制及評估某些藥物治療療效應用最廣泛的模型之一，其誘導的結腸炎動物模型病理表現、臨床癥狀與人類UC 相似［12-13］。

目前小鼠UC 模型的建立方法有多種，但少有對性別差異與動物模型影響因素的相關研究。本實驗通過最常用的3%DSS 溶液誘導UC 小鼠動物模型進行了關于動物性別差異的研究，并成功誘導出了UC 的疾病模型，首次證實了3% DSS 溶液誘導下性別差異與UC 小鼠模型病理程度密切相關，甚至可能影響UC 模型的成模率。本實驗發現雄性小鼠的DAI 指數水平顯著高于雌性小鼠，但雌性小鼠病死率低于雄性小鼠。由此可見，雌性小鼠可能更易于模型的誘導，且該方法容易復制，成模率高，病死率低。

建立符合人類UC 疾病特點的實驗動物模型是基礎研究的重點，但UC 實驗動物模型的建立方法仍缺少一個統一的評判標準，且影響因素較多，如動物的種屬選擇與周齡大小、模型誘導方法（包括誘導試劑的濃度、誘導周期等）、實驗室檢測指標等等，本實驗對常用的化學法誘導的UC 動物模型的性別因素進行了研究，為后期實驗人員建立UC動物模型對動物性別的選擇提供參考依據，但尋找一種UC 臨床相似度高的實驗動物模型尚需進一步探索。