高效液相色譜法測(cè)定慢性胃炎顆粒中芍藥苷的含量

趙明，余春輝，詹思

1.江西省藥品檢查員中心，江西 南昌 330001；2.豐城市中醫(yī)院，江西 豐城 331100

慢性胃炎顆粒為豐城市中醫(yī)院擬申請(qǐng)備案院內(nèi)制劑，該制劑由當(dāng)歸、白芍、木香、陳皮、厚樸、雞內(nèi)金、枳實(shí)、沉香、延胡索、甘草十味中藥制成。其功能主治為疏肝理氣止痛，養(yǎng)血活血和胃，用于肝郁氣滯，胃脘脹痛，噯氣返酸等。為了建立慢性胃炎顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為制劑報(bào)批備案提供確實(shí)可行的技術(shù)依據(jù)，我們選定方中主藥白芍中的有效成分芍藥苷作為定量指標(biāo)控制，來有效地控制本品的質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)證明，采用高效液相色譜法對(duì)本品中的芍藥苷進(jìn)行定量，方法簡(jiǎn)便、靈敏，重現(xiàn)性好。

1 儀器與試藥

安捷倫G1314B檢測(cè)器，G1316A柱溫箱，G1329B 自動(dòng)進(jìn)樣器，G1310A輸液泵，G1322A脫氣機(jī)。島津LC-20AT 輸液泵,SIL-20A 自動(dòng)進(jìn)樣器，SPD-20A 檢測(cè)器，CTO-20A 柱溫箱，DGU-20A5R 脫氣機(jī)，依利特（4.6 mm×250 mm，5 μm）C18 柱，F(xiàn)A1004B電子天平；色譜純乙腈，其他試劑均為分析純；芍藥苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，編號(hào)：110736-202044，含量96%）；慢性胃炎顆粒（豐城市中醫(yī)院制劑室提供，每袋15 g）。

2 方法與結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按表1 進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，柱溫30 ℃。照此條件分析，芍藥苷對(duì)照品和制劑中的其他組分均能達(dá)到基線分離（見圖1 和圖2），理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算均大于2 000，缺白芍的陰性樣品無干擾，專屬性良好（見圖3）。

圖1 芍藥苷對(duì)照品溶液HPLC圖譜

圖2 慢性胃炎顆粒供試品溶液HPLC圖譜

圖3 缺白芍的陰性樣品溶液HPLC圖譜

表1 流動(dòng)相洗脫條件

2.2 波長(zhǎng)選擇

對(duì)照品溶液的制備：取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含60 μg 的溶液，即得。

取芍藥苷對(duì)照品溶液進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果顯示對(duì)照品在232.52 nm 處有一較大的吸收峰，參照《中國(guó)藥典》2015 年版一部白芍藥材中芍藥苷含量測(cè)定項(xiàng)下的檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，選擇230 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 流動(dòng)相的選擇

以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按表1 中的條件進(jìn)行梯度洗脫，芍藥苷與其他組分分離完全，結(jié)果滿意。

實(shí)驗(yàn)對(duì)5 種流動(dòng)相進(jìn)行了對(duì)比，流動(dòng)相Ⅰ：乙腈-0.1%磷酸溶液-三乙胺（13∶87∶0.04）；Ⅱ：乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）；Ⅲ：甲醇-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液（28∶72）；Ⅳ：乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫1），上述條件均因色譜峰峰形差，雜質(zhì)峰干擾較大，最終選擇了流動(dòng)相Ⅴ：乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫2），詳見表2。

表2 五種不同流動(dòng)相比較（n=2）

2.4 供試品溶液的制備

取樣品約6 g，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加稀乙醇35 mL，超聲處理（功率240 W，頻率45 Hz）30 min，放冷，加稀乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.1 不同提取溶劑的比較 試驗(yàn)對(duì)比了70%乙醇及50%甲醇不同溶劑超聲的提取方法，結(jié)果使用稀乙醇提取芍藥苷含量為0.93 mg/g，使用50%甲醇提取芍藥苷含量為0.67 mg/g，表明70%乙醇提取的供試品芍藥苷含量明顯高于50%甲醇提取的，故確定提取溶劑為70%乙醇。

2.4.2 不同提取方法的比較 試驗(yàn)對(duì)比了70%乙醇超聲及70%乙醇回流不同提取方法，結(jié)果使用70%乙醇超聲提取芍藥苷含量為0.93 mg/g，使用70%乙醇回流提取芍藥苷含量為0.94 mg/g?？梢?0%乙醇超聲與回流提取的供試品中芍藥苷含量相差不大，但超聲方法比回流方法操作簡(jiǎn)單、省時(shí)、節(jié)能，故確定提取方法為70%乙醇超聲。

2.4.3 不同提取時(shí)間的比較 試驗(yàn)對(duì)比了70%乙醇超聲15 min、30 min 及45 min 的不同提取時(shí)間，結(jié)果見表3。

表3 打開不同提取時(shí)間的比較

70%乙醇超聲提取15 min 的供試品，芍藥苷含量明顯低于30 min 和45 min，而70%乙醇超聲提取30 min 與45 min 供試品芍藥苷含量相差不大，故確定提取時(shí)間為稀乙醇超聲提取30 min。

2.5 柱溫的考察

按正文含量測(cè)定方法分別在柱溫25 ℃、30 ℃、35 ℃條件下測(cè)定，結(jié)果見表4。

表4 不同柱溫的比較

由上表可見：溫度對(duì)含量測(cè)定的結(jié)果相差不大，再根據(jù)《中國(guó)藥典》2015 版一部白芍藥材含量檢測(cè)方法中未明確規(guī)定柱溫范圍，故對(duì)色譜條件的柱溫不做要求。

2.6 色譜柱的考察

按正文含量測(cè)定方法分別用依利特C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和月旭C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）兩種不同品牌的色譜柱測(cè)定，兩款色譜柱測(cè)定結(jié)果無明顯差異，耐用性良好。

2.7 線性關(guān)系的考察

精密稱取芍藥苷對(duì)照品13.80 mg，置10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，精密吸取5 mL至100 mL 量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，得66.24 μg/mL。再分別精密吸取1 μl、3 μl、5 μl、7 μl、10 μl，按正文中色譜條件分析，測(cè)定峰面積，以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，芍藥苷對(duì)照品的量（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程：Y=1 488.4X+7.751 5，r=0.999 9。表明芍藥苷在0.066 24 μg～0.662 40 μg 范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

2.8 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取芍藥苷對(duì)照品溶液（66.24 μg/mL）10 μL 重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定峰面積，各對(duì)照品溶液的峰面積的RSD 均小于2%。精密吸取本品供試品溶液各10 μL，重復(fù)測(cè)定6 次，結(jié)果樣品中芍藥苷含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.43%，表明此法精密度良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液各10 μL，分別于0、2、4、6、8 h 注入液相色譜儀進(jìn)樣測(cè)定一次，在放置8 h 內(nèi)，芍藥苷的峰面積基本一致。表明芍藥苷甲醇溶液放置8 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 樣回收率試驗(yàn)

取同一批已知含量的慢性胃炎顆粒樣品（批號(hào)20200601，芍藥苷含量0.926 mg/g）6 份，每份約1 g，精密稱定，分別定量加入適量芍藥苷對(duì)照品，按正文中含量測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定含量。結(jié)果見表5，表明此法加樣回收率良好。

表5 芍藥苷回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.11 樣品含量測(cè)定及限量規(guī)定

樣品以芍藥苷為含量控制指標(biāo)，處方中白芍藥材經(jīng)檢測(cè)合格后投料制劑，測(cè)定結(jié)果見表6，不同批次制劑中芍藥苷含量在0.412～0.926 mg/g 之間，藥材到制劑的平均轉(zhuǎn)化率為23.63%。

表6 制劑中芍藥苷含量及轉(zhuǎn)化率結(jié)果

根據(jù)上述測(cè)定結(jié)果，結(jié)合《中國(guó)藥典》2015 年版一部白芍藥材中規(guī)定的芍藥苷含量限度，以及本品芍藥苷的轉(zhuǎn)化率，暫將樣品每克含白芍以芍藥苷（C23H28O11）計(jì)，不得少于0.40 mg。

3 討論

白芍為慢性胃炎顆粒中的主藥，芍藥苷是中藥白芍的主要有效成分，具有舒張平滑肌細(xì)胞的作用和一定的免疫調(diào)節(jié)功能，同時(shí)具有顯著的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥作用。用紫外可見分光光度計(jì)對(duì)芍藥苷對(duì)照品溶液進(jìn)行光譜掃描，確定230 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)，本研究中，對(duì)5 種流動(dòng)相進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果顯示在乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）系統(tǒng)中，樣品分離度符合要求，故擬定流動(dòng)相系統(tǒng)選擇乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）。提取溶劑分別考察了70%乙醇、50%甲醇，同法測(cè)定含量，結(jié)果70%乙醇的溶出量更大，擬定提取溶劑為70%乙醇。同時(shí)對(duì)提取時(shí)間作了比較，超聲提取30 min 和45 min，芍藥苷含量差異不大，因此采用超聲提取30 min，既方便又省時(shí)。通過研究，本方法具有較好的重復(fù)性和較高的精密度，方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，能有效控制產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量，為慢性胃炎顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了科學(xué)根據(jù)。