塞來昔布對實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型小鼠Th1/Th17 細胞分化的抑制作用*

朱 燕，謝曉輝，焦 敏，吳建華，2△

（1. 新疆維吾爾自治區人民醫院，新疆 烏魯木齊 830001；2. 新疆維吾爾自治區臨床藥學研究所，新疆 烏魯木齊 830001）

多發性硬化癥（MS）屬中樞神經系統免疫炎性疾病，臨床表現為強直痙攣、共濟失調、認知功能障礙等。全球范圍內MS 發病率約為十萬分之二，女性發病率明顯高于男性［1］。糖皮質激素為MS 疾病發作急性期的一線藥物，可快速恢復患者的神經功能。β - 干擾素為疾病進展期的一線藥物，旨在抑制T 淋巴細胞活化，減少穿過血腦屏障的炎性細胞因子數量［2］。現階段，主要應用實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）動物模型作為載體進行MS 臨床前研究［3］。塞來昔布屬經典高度特異性環氧合酶2（COX-2）抑制劑，抗炎選擇性較高，已獲批用于類風濕關節炎和其他免疫炎性疾病的治療。有研究顯示，塞來昔布具有中樞神經系統保護作用，并能抑制T 淋巴細胞的活化，減少花生四烯酸向前列環素/前列腺素和血栓素轉化，且減少其他炎性細胞因子的分泌［4］。然而，關于塞來昔布治療EAE 的基礎研究至今鮮有報道。為此，本研究中擬采用外源性髓鞘抗原誘導小鼠復制EAE 模型，探討塞來昔布對EAE 的改善效果及對T淋巴細胞活化的影響。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：BX53 型光學顯微鏡（日本Olympus 公司）；IC1000 型細胞計數儀（上海Countstar 公司）；CytoFLEX型流式細胞儀（美國Beckman 公司）；Fc 型酶標儀（美國Thermo 公司）；Mini- protean Tetra 型凝膠電泳裝置（美國Biorad 公司）；5200 型化學發光成像儀（上海天能生物技術有限公司）。

試藥：塞來昔布（美國MCE 公司，批號為M538736，含量>99.0%）；鼠源髓磷脂少突膠質細胞糖蛋白35-55（MOG35-55）、完全弗氏佐劑（CFA）、百日咳毒素（PTX），均購自美國Sigma 公司（批號分別為s101834，s111972，s101721）；FITC - anti - mouse CD4抗體、FITC - anti -mouse CD8抗體、PE - Anti - mouse IL - 17 抗體、PEAnti-mouse IFN-γ抗體均購自美國Biolegend公司（批號 分 別 為137057，148732，120983，142711）；Anti -mouse COX - 2 抗體、Anti - mouse p - NF - κB 抗體、Anti - mouse NF - κB 抗體、Anti - mouse NLRP3 抗體、Anti-mouse β-actin 抗體、HRP conjugated IgG（H+L）抗體，均購自北京博奧森生物技術有限公司（批號分別為bs1832，bs1283，bs2192，bs1129，bs1837，bs1655）；羅氏（LFB）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號為s3292）；白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒，均購自深圳達科為生物技術股份有限公司（批號分別為1005-1307，1008-1725，1002-1335）；臺盼藍染色液（美國Gibco 生物公司，批號為13704）；RIPA組織裂解液（上海碧云天生物技術有限公司，批號為b190372）；ECL 超敏發光液（上海天能生物技術有限公司公司，批號為1605）。

動物：健康SPF級C57BL/6 小鼠36只，雄性，7～8周齡，體質量22～26 g，購自新疆醫科大學動物實驗中心，動物生產許可證號SCXK（新）2018-0001。飼養于新疆醫科大學動物實驗中心SPF級動物房中，環境溫度（22±2）℃，相對濕度（55±5）%，人工晝夜（12h/12h）交替。所有大鼠自由飲食攝水，適應性喂養1 周。本研究動物實驗研究方案基于“3R”原則開展，獲得了新疆醫科大學動物實驗倫理委員會批準。

1.2 方法

建模、分組及給藥：將36只大鼠根據體質量及活躍度隨機分為對照組（等體積生理鹽水）、模型組（等體積生理鹽水）、塞來昔布組（5 mg/ kg），各12 只。將MOG35-55多肽用磷酸緩沖鹽液（PBS）稀釋至6 mg/mL，與CFA 等體積混合。使用雙通道連接器連接5 mL 注射器，反復推拉混合制成MOG35-55油包水抗原乳劑（現配現用）。取模型組與塞來昔布組小鼠進行抗原免疫，背部多點皮下注射抗原乳劑，每只小鼠4點，共注射0.2 mL抗原乳劑（MOG35-55多肽含量為每只600 μg）；抗原乳劑免疫結束后0 h和48 h，給予PTX腹腔注射（每只0.1 mL，含百日咳桿菌活菌109個）作為增敏劑以提高模型發病率。建模成功后，各組小鼠灌胃給予相應藥物或生理鹽水，每天1次，連續35 d。

神經功能缺損評分：給藥期間每天觀察小鼠并進行神經功能缺損評分。0分，無任何臨床癥狀；0.5分，尾部肌張力減弱，尾部尖端下垂；1 分，尾部尖端下垂伴步態蹣跚；1.5分，尾部無力伴步態蹣跚；2分，兩后肢不完全癱瘓（即一后肢或兩后肢癱瘓）；2.5 分，單后肢癱瘓伴另一后肢不完全癱瘓；3分，雙后肢完全癱瘓；3.5分，雙后肢癱瘓，前肢肌張力減弱或癱瘓；4 分，雙后肢完全癱瘓伴一只前肢不完全癱瘓；5分，瀕死狀態或死亡。

脊髓髓鞘脫失程度觀察：末次給藥后，以CO2安樂死法處死小鼠（3 只），立即打開腹腔，穿破心尖灌注生理鹽水，剪開心耳，沖洗出血液。待沖洗出液體無色，灌注4%多聚甲醛固定液。用鑷子小心剪除脊柱周圍組織，逐節暴露脊柱，完整剝離脊柱，于4%多聚甲醛固定液中固定12 h 以上。以75%，85%，95%，100%乙醇逐級脫水。再以二甲苯乙醇混合液（1∶1，V/V），二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ浸泡脊髓，透化組織。將組織進行石蠟包埋，切片（5 μm）。切片以二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脫蠟，經乙醇水化，蒸餾水清洗，浸入0.1%LFB 溶液中，60 ℃溫箱中浸染8～12 h，蒸餾水沖洗，在0.05%碳酸鋰水溶液中分色10 s，70%酒精繼續分色，蒸餾水沖洗1 h。自然晾干，以伊紅染色液染色30 s，二甲苯透化，中性樹脂封片。在光學顯微鏡觀察并拍片。

脊髓單核細胞中CD4+/CD8+T 細胞占比測定：末次給藥后，CO2安樂死處死小鼠（3 只），剪開背部皮膚，用鑷子剪除脊柱周圍組織，逐節暴露脊柱，完整剝離脊柱，沿脊柱長軸方向將注射器插入脊柱，推動注射器，以PBS沖洗出脊髓。400g離心5 min，棄上清液，加入1 mL 0.05%胰酶消化，加入5 mL 含血清培養基終止消化。400g離心5 min，棄上清液，細胞沉淀加入5 mL 含血清培養基重懸。取20 μL 細胞懸液，以臺盼藍染液對細胞染色，采用細胞計數儀進行計數。取1×106個脊髓單核細胞，PBS 洗3 次，加入Anti- CD4與Anti- CD8流式熒光抗體重懸細胞，4 ℃孵育30 min。400g離心5 min，留沉淀，PBS 洗2 次。加入200 μL PBS 重懸細胞，采用流式細胞儀測定。

脊髓單核細胞中CD4+T細胞分化程度分析：取1×106個脊髓單核細胞，PBS 洗3 次，留沉淀。加入Anti - CD4、Anti-IFN-γ（Th1）/Anti-IL-17（Th17）流式熒光抗體重懸細胞，4 ℃孵育30 min，400g離心5 min，留沉淀，PBS 洗2 次。加入200 μL PBS 重懸細胞，采用流式細胞儀分析。

脊髓單核細胞中炎性因子水平檢測：采用ELISA法。取30 mg 脊髓組織，液氮冷凍，加入RIPA 組織裂解液勻漿，提取蛋白。12 000 r/ min 離心20 min，取上清液，測定蛋白濃度。設置空白孔、待測樣品孔進行加樣，室溫孵育2 h。清洗3 次后拍干，每孔中加入100 μL Bio?tiny抗體工作液，室溫孵育1 h。清洗3次后拍干，每孔中加入100 μL 親和鏈霉素-HRP 工作液，室溫避光孵育20 min。清洗3次后拍干，每孔中加入100 μL，3，3，5，5-四甲基聯苯胺（TMB）溶液，室溫避光孵育5～20 min，根據顏色變化加入終止液，以酶標儀在450 nm波長處檢測各組樣品的吸光度（OD）值，繪制標準曲線，計算即得。

脊髓組織中COX-2、核因子κB（NF-κB）、含NLR家族Pyrin 域蛋白3（NLRP3）蛋白表達水平檢測：采用Western blot 法。同上述方法測定上清液中蛋白濃度。加入上樣緩沖液，100 ℃金屬浴中使蛋白變性。各組取約10 μg上樣，濕轉（2 mA/60 min）。以4%脫脂奶粉封閉，磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）清洗3 次，加入一抗溶液，4 ℃過夜，PBST 清洗3 次，室溫避光孵育HRP 標記的山羊抗兔/鼠IgG（H+L）二抗稀釋液2 h，PBST 清洗3 次，滴加ECL 超敏發光液，顯影儀下顯影，獲得不同灰度條帶并使用Image J 軟件分析，以β-actin 作為內參，計算即得。

1.3 統計學處理

采用SPSS 21.0 統計學軟件分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組數據間比較采用單因素方差分析（One-way Anova），各組數據兩兩比較采用Tukey檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經功能

對照組小鼠未出現任何EAE 癥狀。模型組，給藥第8天，部分小鼠出現神經功能損傷癥狀；第14天，所有小鼠均出現不同程度的EAE 癥狀；第21 天，小鼠EAE 癥狀達到高峰，第23 天時，神經功能缺損評分最高，為（3.33 ± 0.54）分；第28 天開始，小鼠EAE 癥狀逐漸緩解，神經功能缺損評分開始降低。塞來昔布組，給藥第12 天，部分小鼠出現EAE 癥狀；第19 天，所有小鼠出現不同程度的EAE 癥狀；第26 天，神經功能缺損評分最高，為（1.75 ± 0.68）分；之后，小鼠EAE 癥狀逐漸緩解；第35 天時，神經功能缺損評分為0～1 分。詳見圖1。

圖1 各組小鼠神經功能缺損評分Fig.1 Neurological deficit score of mice in each group

2.2 髓鞘脫失程度

對照組小鼠脊髓組織髓鞘完整；模型組小鼠脊髓髓鞘脫失嚴重，表現為局部區域染色較淡，髓鞘間距增加且有較多的空泡區，甚至出現髓鞘的斷裂；塞來昔布組雖可見部分髓鞘破壞，但整體染色較模型組更深，且髓鞘空泡區域較少。詳見圖2。

A1，B1，C1. 全視野圖 A2，B2，C2. 局部視野圖（×400）A. 對照組 B. 模型組 C. 塞來昔布組圖2 小鼠脊髓組織脫髓鞘羅氏染色圖（*表示脊髓髓鞘脫失區域）A1，B1，C1.Full view A2，B2，C2.Partial view（×400）A.Control group B. Model group C.Celecoxib groupFig.2 LFB staining of demyelination in spinal cord tissues of mice（ * represents the demyelination region in spinal cord ）

2.3 CD4+ /CD8+ T 細胞占比

與對照組比較，模型組小鼠脊髓中CD4+T 細胞與CD8+T 細胞顯著增加（P<0.05）；與模型組比較，塞來昔布組小鼠脊髓中CD4+T細胞占比顯著降低（P<0.05），CD8+T細胞占比無顯著改變（P>0.05）。詳見圖3。

A1，B1.CD4+T細胞 A2，B2.CD8+T細胞A. 流式細胞圖 B. 統計數據圖3 各組小鼠脊髓中CD4+與CD8+T細胞占比注：與對照組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05。圖4、表1、圖5同。A1，B1.CD4+T cells A2，B2.CD8+T cellsA.Flow cytometry plot B.Data statisticsFig.3 Proportion of CD4+ T cells and CD8+ T cells in spinal cord of mice in each groupNote：Compared with those in the control group，*P < 0.05（for Fig.3-5 and Tab.1）；Compared with those in the model group，#P < 0.05（for Fig.3-5 and Tab.1）.

2.4 CD4+ T 細胞分化程度

與對照組比較，模型組小鼠脊髓的CD4+T 細胞中Th1 與Th17 占比顯著升高（P< 0.05）；與模型組比較，塞來昔布組小鼠脊髓的CD4+T細胞中Th1與Th17占比顯著降低（P<0.05）。詳見圖4。

2.5 炎性因子水平

與對照組比較，模型組小鼠脊髓中TNF-α、IL-6、IL-1β 水平顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，塞來昔布組小鼠脊髓中TNF-α，IL-6，IL-1β 水平顯著降低（P<0.05）。詳見表1。

表1 各組小鼠脊髓中TNF-α、IL-6、IL-1β表達水平比較（±s，pg/mL，n=3）Tab.1 Comparision of expression levels of TNF - α，IL - 6 and IL - 1β in spinal cord of mice in each group（±s，pg/mL，n=3）

表1 各組小鼠脊髓中TNF-α、IL-6、IL-1β表達水平比較（±s，pg/mL，n=3）Tab.1 Comparision of expression levels of TNF - α，IL - 6 and IL - 1β in spinal cord of mice in each group（±s，pg/mL，n=3）

組別對照組模型組塞來昔布組TNF-α 223.87±22.74 353.08±43.41*277.17±44.04#IL-6 59.87±11.44 123.54±9.93*94.39±16.77#IL-1β 55.93±9.68 91.85±7.00*83.44±9.19#

2.6 COX-2，NF-κB，NLRP3 蛋白表達水平

與對照組比較，模型組小鼠脊髓中COX - 2，p -NF-κB，NLRP3蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，塞來昔布組小鼠脊髓中COX-2，p-NF-κB，NLRP3蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）。詳見圖5。

3 討論

MS 是由內源性髓磷脂抗原靶向激活CD4+T 細胞和CD8+T 細胞，造成嚴重的神經炎癥并破壞神經細胞髓鞘，導致進行性神經功能障礙。由外源性髓磷脂少突膠質糖蛋白誘導的EAE，在臨床癥狀與組織病理學方面，髓鞘組織和血腦屏障的破壞與MS 十分相似［5］。故小鼠EAE 模型常用于MS 發病機制研究與新療法的開發。本研究中，小鼠采用MOG35-55混合乳劑免疫，在免疫時間到達第2周，模型組小鼠神經功能缺損評分逐漸升高，陸續出現肌張力消失，拖尾且伴有癱瘓的現象。這與臨床MS 患者肢體無力、半身不遂的癥狀相吻合。一直以來，自身抗原免疫介導的髓鞘破壞被認為是MS的主要病理表現。多項有關MS的影像學研究均表明，進行性髓鞘脫失是導致MS患者發生不可逆性神經功能損傷的主要原因［6-7］。本研究中，LFB染色顯示模型組小鼠脊髓中髓鞘脫失明顯。綜合以上小鼠神經功能缺損評分與病理切片結果，提示EAE小鼠模型復制成功。

COX是花生四烯酸代謝的限速酶，主要分為COX-1和COX-2 兩種亞型。COX-2 為同工酶，屬誘生型酶，在脊髓組織中廣泛分布，當細胞受到炎性刺激時，脊髓中COX - 2 表達水平升高，促進前列腺素、前列環素和血栓素等炎性因子的合成，導致炎性反應［8］。COX - 2在健康大腦的神經細胞和內皮細胞中表達。在EAE 大鼠中，炎性病變的內皮細胞中COX - 2 的表達上調［9］。本研究中，ELISA檢測結果顯示模型小鼠脊髓中TNF-α，IL-1β，IL-6水平顯著升高。此外，Western blot結果顯示，COX-2，NLRP3，p-NF-κB 在模型小鼠脊髓中表達水平顯著升高。因此，MOG35-55混合乳劑免疫誘導小鼠EAE可能是通過上調COX-2水平達成的。

A1，B1.Th1細胞 A2，B2.Th17細胞A. 流式細胞圖 B. 統計數據圖4 各組小鼠脊髓中CD4+ T細胞中Th1與Th17細胞占比A1，B1.Th1 cells A2，B2.Th17 cellsA.Flow cytometry plot B.Data statisticsFig.4 Proportion of Th1 cells and Th17 cells in CD4+ T cells in spinal cord of mice in each group

B1.COX - 2 B2.p - NF - κB B3.NLRP3A. 電泳圖 B. 統計數據圖5 各組小鼠脊髓中COX-2、p-NF-κB、NLRP3蛋白表達水平B1.COX-2 B2.p-NF-κB B3.NLRP3A.Electrophoretic map B.Data statisticsFig.5 Expression levels of COX-2，p-NF-κB，NLRP3 protein in the spinal cord of mice in each group

塞來昔布對COX-2的親和力是COX-1的700倍，可選擇性抑制COX-2活性而發揮抗炎作用，可避免抑制COX - 1 活性而防止胃腸道反應的發生［10］，故具有更好的抗炎選擇性與更低的副作用。臨床類風濕關節炎患者的治療研究顯示，塞來昔布相比于布洛芬，在炎性細胞因子及類風濕因子水平調節方面作用更強，且藥品不良反應發生率更低［11］。同時，塞來昔布在中樞神經系統退行性疾病中也有廣泛的應用，如在抑郁樣行為動物模型中，可通過提高海馬組織中抗氧化保護作用，減輕氧化應激，發揮抗抑郁樣行為作用［12］。上述結論為塞來昔布在EAE 中治療的應用提供了理論基礎。本研究中，塞來昔布組小鼠神經功能損傷的時間軸明顯延后，且神經功能缺損評分峰值顯著低于模型組；同時，治療后期小鼠神經功能損傷癥狀明顯減輕。LFB 染色顯示小鼠脫髓鞘反應明顯改善，ELISA 檢測結果顯示炎性細胞因子分泌明顯減少。故塞來昔布能顯著改善EAE模型小鼠病理癥狀。

EAE 發病過程中，T 細胞的過度活化與增殖是介導中樞神經系統病變的重要原因［13］。本研究中，模型小鼠CD4+T 細胞與CD8+T 細胞均出現明顯增殖現象。但塞來昔布在顯著抑制CD4+T 細胞增殖的同時，對CD8+T細胞的增殖也存在一定的抑制。其原因可能是，塞來昔布改善模型小鼠病理癥狀主要是通過抑制CD4+T細胞增殖介導的。有學者提出，髓磷脂誘導的CD4+T細胞分化在自身免疫性脫髓鞘疾病中起著驅動器的作用［14］。本研究中將目標集中于塞來昔布對CD4+T細胞分化的調節上。在抗原免疫過程中，髓鞘抗原刺激T 細胞在外周免疫器官中分化為Th1 與Th17 效應細胞，穿過血腦屏障，遷移至中樞神經系統造成EAE。Th1 與Th17在誘導EAE的過程中，不斷釋放IFN-γ、TNF-α、IL-17 等炎性細胞因子，造成炎性浸潤，導致髓鞘脫失。已有研究報道，IFN-γ 與IL-17 能正反饋調節多種細胞因子如TNF - α，IL - 1β，IL - 6 的生成，放大機體中炎性級聯反應，進而破壞髓鞘組織［15］。此外，將體外培養的分泌IL - 17 的Th17 細胞與分泌IFN - γ 的Th1 細胞注射入正常小鼠體內，均會誘導EAE的發病與進展［16］。本研究中，與對照組比較，模型組小鼠脊髓中Th1 與Th17 在CD4+T 細胞中占比顯著增加；與模型組比較，塞來昔布組上述指標顯著降低。

綜上所述，本研究中利用MOG35-55混合乳劑免疫小鼠構建了EAE 模型，并證實了塞來昔布能有效改善小鼠EAE 癥狀。通過對脊髓細胞的提取與檢測，初步證實塞來昔布通過抑制COX - 2 表達，抑制CD4+T 細胞增殖，減少CD4+T 細胞向Th1 與Th17 細胞分化及炎性細胞因子的分泌，最終改善小鼠髓鞘脫失的情況。