3D 打印多孔鉭浸提液體外細胞毒性和遺傳毒性研究*

蔣 波，張 玲，張 佩，彭 蘭，楊 柳，王 旖，曾榮榮

（1. 重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121； 2. 重慶醫藥高等專科學校，重慶 401331）

近年來，醫用增材制造技術（3D 打印）在醫療領域發展迅速，以3D打印技術制備的各類醫用增材，為再生醫學領域復雜組織器官的制造帶來了希望。以3D 打印制備的多孔鉭被認為是目前最理想的骨科植入材料，可根據患者的需求制成個體化植入體，廣泛應用于股骨頭壞死、關節置換、骨缺損等骨科領域［1］。目前，國內外關于3D 打印多孔鉭制備與性能的研究報道較多，但關于其生物相容性評價的資料較少。本研究中參考醫療器械生物學評價國家標準［2-3］及醫療器械行業標準［4-6］，采用體外細胞毒性試驗、細菌回復突變試驗（Ames 試驗）、體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗及體內哺乳動物骨髓細胞微核試驗，對3D 打印多孔鉭潛在的細胞毒性及遺傳毒性進行研究，旨在為探索醫用增材類醫療器械的生物安全性提供參考。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：MJ-250F-Ⅲ型微生物培養箱（上海龍躍儀器設備）；CB150 型CO2培養箱（德國Binder 公司）；CX21FSIC 型顯微鏡；IX71 型倒置生物顯微鏡（日本Olympus 公司）；Synergy HTX 型多功能酶標儀（美國Biotek公司）。

試劑與樣品：大鼠肝臟微粒體酶S9（江蘇齊氏生物科技有限公司，批號為19FS063M）；2，4，7-三硝基-9-芴酮（美國AccuStandard公司，批號為212111087）；疊氮化鈉（浙江東陽天宇化工，批號為20000406）；絲裂霉素 C（MMC，MYM Biologich Technology，批 號 為SLBD1982V）；甲磺酸甲酯（批號為1001800914），2-氨基芴（批號為101393989），秋水仙素（批號為011M1244V），環磷酰胺（CP，批號為1001686731），均購自美國Sigma - Aldrich 公司；吉姆薩染色液（上海樂辰生物科技有限公司，批號為20200528）；RPMI 完全1640培養液（批號為20200220）、MTT 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（批號為20200510），均購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。多孔鉭材料（重慶某材料公司，3D打印方式制備）。

動物：健康SPF級KM 小鼠50只，雌雄各半，體質量20～22 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（京）2019-0010，實驗動物質量合格證號1103242011011279。飼養于重慶市食品藥品檢驗檢測研究院藥理毒理室屏障系統，實驗動物使用許可證號SYXK（渝）2015-0002。動物房室溫16～26 ℃，日溫差不超過4℃，相對濕度40%～70%，12 h/ 12 h 明暗交替，試驗期間動物飼喂全價營養顆粒飼料，滅菌自來水自由飲用。

菌株：鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養缺陷型突變株TA97a（批號為5462D）、TA98（批號為5470D）、TA100（批號為5467D）、TA102（批號為5468D）、TA1535（批號為5469D），均購于美國Moltox 公司，貯存于液氮生物容器內。

細胞株：小鼠成纖維肌細胞L929（批號為20180511），中國倉鼠肺細胞CHL（批號為20200330），均購于中國科學院上海細胞庫，貯存于液氮生物容器內。

1.2 方法

樣品浸提液制備：取多孔鉭適量，稱量后121 ℃濕熱滅菌30 min，以氯化鈉注射液和注射用大豆油分別作為極性和非極性浸提介質［7］，在（37±1）℃條件下浸提（72±2）h，制成樣品浸提液A 和B（0.2 g/mL）。取多孔鉭適量，稱量后121 ℃濕熱滅菌30 min，以RPMI 完全1640 培養液浸提，在（37 ± 1）℃條件下浸提（24 ± 2）h，制成樣品浸提液C（1S-100%），加入3倍量的RPMI完全1640培養液制成樣品浸提液C（2S-75%），同法分別制成樣品浸提液C（3S-50%）、樣品浸提液C（4S-25%）。

體外細胞毒性試驗：取傳代48～72 h的L929 細胞，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化，離心后加入RPMI完全1640培養液重懸細胞懸液，制成細胞密度為1×105mL-1的細胞懸液。取細胞懸液接種于96孔板中（每孔100 μL），于37 ℃條件下CO2培養箱中培養24 h；倒置顯微鏡下觀察細胞狀態，確保各孔細胞增長相對相等，吸出培養基，分組，加入樣品浸提液C1，C2，C3，C4100 μL，陰性對照組（高密度聚乙烯浸提液）、陽性對照組（10%DMSO）及空白對照組（RPMI 完全1640 培養液），于37 ℃條件下CO2培養箱中培養24 h，倒置顯微鏡下觀察細胞形態；吸出培養基，各孔加入50 μL MTT 溶液，在37 ℃條件下CO2培養箱中孵育4 h，棄去MTT 溶液，各孔加入150 μL DMSO，低速振蕩10 min，以酶標儀檢測570 nm波長處的吸光度（OD570）值，計算各組細胞存活率（OD570樣品/OD570空白× 100%），并按6 級毒性評級標準作毒性級別評定［8］。

體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗：取CHL 細胞，分別在加或不加S9液條件下試驗［5］，取樣品浸提液C1，C2，C3，C4，分別設為C1組、C2組、C3組、C4組，并設溶劑對照組（RPMI 完全1640 培養液浸提），絲裂霉素C（不加S9 液，終質量濃度0.2 μg/mL）、環磷酰胺（加S9 液，終質量濃度15 μg/mL）分別作為陽性對照1組、2組。正式試驗前1 d，取對數生長期CHL細胞，接種于25 cm2細胞培養瓶中（1×106個/瓶），置37 ℃條件下CO2培養箱中培養24 h，確保細胞覆蓋程度大于60%。試驗時，傾去培養液，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2 次，各組加相應溶液（終濃度1%）及S9液，置培養箱培養4 h，去上清，PBS清洗2 次，加入完全1640 培養液繼續培養20 h，加入秋水仙素（終質量濃度1 μg/mL）處理4 h，觀察細胞生長狀態后收獲細胞，低滲、固定、常規制片，染色，鏡檢；不加S9 液條件，各組加入相應溶液，分別培養4 h 和24 h 后，同法制片。在油鏡下每組觀察200個分散良好的中期分裂相細胞，記錄染色體畸變細胞數和畸變類型，計算細胞畸變率。在加或不加S9液的條件下，若出現C1～C4組與溶劑對照組染色體畸變率差異有統計學意義并呈量效關系，則判定結果為陽性。

Ames試驗：取5種試驗用菌株，在加或不加S9液條件下試驗［4］。設A 組及B 組（樣品浸提液A 和B）及溶劑對照1 組、2 組（氯化鈉注射液，注射用大豆油），分別以2，4，7-三硝基-9-芴酮（TA97a、TA98菌株不加S9液條件下的陽性物）、甲磺酸甲酯（TA100、TA102 菌株不加S9條件下的陽性物）、疊氮化鈉（TA1535菌株不加S9液條件下的陽性物）、2-氨基芴（TA97a、TA98、TA100、TA102 菌株加S9 條件下的陽性物）、CP（TA1535 菌株加S9條件下的陽性物）為陽性對照1組、2組、3組、4組、5 組，同時設置空白對照組。采用平板摻入法，在保溫的頂層瓊脂試管中依次加入0.5 mL 10% S9 液或PBS（不加S9 液條件），0.1 mL 樣品浸提液A，B 0.1 mL 預先振蕩培養的各菌株增菌液；溶劑對照組加入0.1 mL 相應浸提介質，陽性對照1 組、2 組、3 組、4 組、5 組分別加入0.1 mL 相應陽性對照物（每皿分別含0.5，5.0，0.5，50.0，200.0 μg），空白對照組僅加菌液，其余操作同樣品組。每組做3 管平行樣，混勻后迅速將各管中溶液傾倒在底層瓊脂上，轉動平皿使混合液均勻分布于底層瓊脂，平放固化后倒置于37 ℃條件下CO2培養箱中培養48 h，計數每皿回變菌落數，并計算平均值和標準差。試驗重復2 次，在加或不加S9 液的條件下，若A組、B組有1個或多個菌株的回變菌落數是溶劑對照組的2倍或2倍以上并有可重復性，則判定結果為陽性。

體內哺乳動物骨髓細胞微核試驗：將50只KM小鼠先按體質量隨機分為5組，各10只，雌雄各半。設A組及B組（樣品浸提液A和B）組，溶劑對照1組、2組（同Ames試驗）和陽性對照組（環磷酰胺50 mg/kg）。各組小鼠腹腔注射相應藥物20 mL/kg，間隔24 h給藥1次，第2次給藥后6 h 脫頸處死小鼠，取股骨骨髓涂于事先加有1 滴小牛血清的玻片上，混勻推片，自然晾干，甲醇固定后染色觀察。油鏡下觀察每只小鼠2 000 個嗜多染紅細胞（PCE），記錄含微核細胞數。同時觀察200個PCE計數中見到的正染紅細胞（NCE）數，計算PCE/（NCE+PCE）。溶劑對照組的微核率應<5‰，A組及B組與溶劑對照組比較，微核率有顯著升高時判定結果為陽性。

1.3 統計學處理

采用SPSS 19.0 統計學軟件分析。計量資料以±s表示，行t檢驗；計數資料以率（%）表示，行χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體外細胞毒性試驗

L929 細胞接觸浸樣品浸提液C1～C424 h 后，胞漿內有離散顆粒，無細胞溶解，與空白對照組細胞形態無差異。樣品浸提液C1～C4接觸后細胞存活率均大于75%，毒性評級均為1級，無潛在細胞毒性。詳見表1。

表1 細胞毒性試驗結果（n=6）Tab.1 Results of the cytotoxicity test（n=6）

2.2 體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗

不加S9 液條件下，除陽性對照1 組4 h 畸變率為16%外，其余各組均為0；加S9 液條件下，除陽性對照2 組4 h畸變率為17%外，其余各組均為0。詳見表2。

表2 CHL細胞染色體畸變試驗結果Tab.2 Results of the chromosome aberration test of CHL cells

2.3 Ames 試驗

在加或不加S9液條件下，空白對照組5種菌株回變菌落數符合文獻［9］及相關標準數據［4］，溶劑對照1 組、2 組回變菌落數與空白對照組相當，各陽性對照組回變菌落數顯著多于溶劑對照組（P<0.01），顯示出強烈的誘變作用，表明該試驗系統符合要求。在加和不加S9液條件下，A 組、B 組與相應溶劑對照組比較無顯著差異（P>0.05），兩次試驗結果一致，表明2種樣品浸提液無抑菌作用，無誘發細菌回復突變性。詳見表3。

表3 Ames試驗菌株回變菌落數（±s，個，n=3）Tab.3 Number of revertant colonies of strains in the Ames tests（±s，n=3）

表3 Ames試驗菌株回變菌落數（±s，個，n=3）Tab.3 Number of revertant colonies of strains in the Ames tests（±s，n=3）

組別空白對照組溶劑對照1組溶劑對照2組A組B組陽性對照1組陽性對照2組陽性對照3組陽性對照4組陽性對照5組S9-+ - + - + - + - + - - - + +第1次TA97a 177.3±7.2 178.7±10.4 172.7±11.2 166.0±4.6 163.3±10.2 169.7±10.0 181.0±15.7 172.7±9.5 171.3±11.6 169.7±17.6 663.3±40.4**986.7±77.5**TA98 31.3±3.2 30.7±3.2 31.0±2.0 33.3±4.0 32.7±2.3 32.0±4.6 33.7±4.9 33.0±1.0 31.3±2.5 31.7±4.9 1 816.7±141.6**946.0±111.6**TA100 171.3±11.9 182.3±8.0 169.0±10.8 174.0±19.3 178.0±9.2 164.7±7.1 168.7±6.8 170.7±11.6 175.0±15.1 178.0±6.0 1 950.7±57.7**1 168.3±66.7**TA102 275.0±9.6 299.0±12.8 267.7±15.1 292.7±9.7 265.7±15.0 298.3±13.7 265.0±12.1 272.0±7.9 267.0±9.8 273.0±14.5 1 274.3±145.8**845.0±95.8**TA1 535 12.0±1.0 13.3±2.5 14.7±2.5 12.7±3.1 12.3±1.2 13.3±4.2 16.3±3.1 13.3±2.9 14.3±2.5 13.3±1.2 1 039.7±94.7**629.0±117.8**第2次TA97a 166.0±13.5 176.7±11.1 159.3±10.4 177.3±19.5 167.3±16.4 179.7±12.7 164.0±10.1 174.0±10.4 169.0±10.0 175.0±8.5 892.7±79.0**850.7±24.4**TA98 33.7±2.5 35.7±3.2 31.0±4.0 31.7±4.7 30.7±3.5 31.3±2.5 33.7±4.9 30.7±3.8 31.7±3.8 32.0±4.4 1 460.0±156.2**1 260.0±180.0**TA100 180.0±5.3 189.0±15.9 175.7±11.4 171.7±9.5 178.7±11.7 170.3±14.7 172.7±13.2 182.0±17.1 173.7±10.3 186.0±8.5 1 970.7±133.4**2 302.7±167.8**TA102 264.3±11.0 274.0±11.5 269.7±17.5 285.0±22.3 271.7±22.0 290.7±17.2 286.3±22.5 292.7±17.5 282.0±17.3 289.7±17.8 1 217.3±77.4**748.7±32.6**TA1535 12.7±3.1 13.7±1.5 13.3±2.5 13.0±2.6 12.3±1.5 13.3±3.2 14.7±3.1 15.3±1.5 15.0±3.0 13.7±2.1 1 267.5±142**698±72.1**

2.4 體內哺乳動物骨髓細胞微核試驗

與溶劑對照組比較，陽性對照組小鼠PCE 中微核明顯增多，微核率顯著升高（P< 0.01），A 組、B 組小鼠PCE微核率與相應溶劑對照組比較無明顯差異（P>0.05）。詳見表4。

表4 小鼠骨髓微核試驗結果（±s，n=20 000）Tab.4 Results of the bone marrow micronucleus test in mice（±s，n=20 000）

表4 小鼠骨髓微核試驗結果（±s，n=20 000）Tab.4 Results of the bone marrow micronucleus test in mice（±s，n=20 000）

組別溶劑對照1組溶劑對照2組A組B組陽性對照組微核數45 39 41 36 381微核率（‰）2.25±0.59 2.05±0.90 1.95±0.69 1.80±0.63 19.05±2.73**PCE/（NCE +PCE）0.55±0.06 0.53±0.09 0.52±0.06 0.57±0.07 0.50±0.06

3 討論

醫用增材多以植入體內的方式應用于臨床，故探討醫用增材類醫療器械原料和成品的生物安全性具有重要意義，為確保醫用增材在臨床應用時的安全性，在完成理化性能、加工性能及外形等有效性測試后，必須對成型材料進行生物相容性評價［10］。體外細胞毒性試驗是安全性評價的一項基本內容，可用于初步了解醫療器械產品的安全性。遺傳毒性研究是生物安全性評價的重要內容，與致癌性、生殖毒性等其他毒理學研究密切相關［11］，試驗方法根據檢測的遺傳學終點可分為基因突變、染色體畸變和DNA 損傷3 大類，根據試驗系統又可分為體外試驗和體內試驗，目前尚無一種遺傳毒性試驗方法能檢測出所有類別的遺傳毒性機制，因此在實踐中常組合采用多種方法，以相互補充，全面評估受試樣品的遺傳毒性風險［12］。

與普通化學物質的遺傳毒理學研究不同，醫療器械多采用樣品浸提液進行試驗，當浸提液未表現出明顯的體內體外毒性時，在進行遺傳毒性試驗時可選擇單一劑量（即100%樣品浸提液）進行研究［13-14］。故本研究中首先進行體外細胞毒性試驗，以3D 打印多孔鉭浸提液及稀釋液與L929 細胞直接接觸，結果表明，100%樣品浸提液及稀釋液均不具有細胞毒性。其后的遺傳毒性研究中組合使用Ames 試驗、染色體畸變試驗、微核試驗，從基因水平、染色體水平、動物體內水平3個層面對3D打印多孔鉭進行了致突變作用研究，并在進行體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗時選擇同細胞毒性試驗相同的劑量。同時，由于浸提樣品所使用的含血清細胞培養液兼具極性和非極性介質的特性，細胞毒性結果提示，由單一惰性金屬材料鉭制成的醫療器械，其極性和非極性浸提介質條件下均具有低毒性，故在Ames試驗和微核試驗中2種浸提介質條件下，樣品浸提液組均僅使用100%樣品浸提液。

本研究結果表明，根據體外細胞毒性試驗結果評估醫用增材的毒性，可為某些體外遺傳毒性試驗劑量設計提供參考。但由于本研究的對象是由惰性較強的鉭材料制成，樣品未體現出顯著的細胞毒性，這種試驗設計思路還需后續更深入研究，可選用一系列具有明確細胞毒性的樣品，根據細胞毒性的結果設計遺傳毒性的劑量，從中探明樣品細胞毒性與遺傳毒性的關聯性，從而建立起一套體外細胞毒性與遺傳毒性綜合的生物學評價標準。

綜上所述，不同濃度3D 打印多孔鉭浸提液均無細胞毒性，3 種遺傳毒性試驗（Ames 試驗、染色體畸變試驗、微核試驗）結果均為致突變陰性，表明3D 打印多孔鉭無遺傳毒性。該細胞毒性試驗結合遺傳毒性試驗的評價體系可供建立醫用增材生物學評價方法參考。