注射用三磷酸胞苷二鈉含量均勻度測定方法研究*

張雪艷，周長明，趙 璇

（北京市藥品檢驗研究院·國家藥品監督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室·中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室，北京 102206）

三磷酸胞苷二鈉（CTP）屬核苷酸衍生物，主要參與核酸及磷脂的代謝，促進蛋白質合成。CTP 可在人體內轉化成二磷酸胞苷（CDP）和一磷酸胞苷（CMP），并釋放能量，是腦磷脂合成與核酸代謝的中間產物和能量來源，可通過血- 腦屏障，提高神經細胞抗損傷能力，對腦組織有營養、促進再生、修復的作用［1-2］。考察7 廠家29 批注射用三磷酸胞苷二鈉的含量均勻度時，發現各家企業標準中該檢查項差異較大，2 家未設定該檢查項，5 家采用紫外-可見分光光度法，在280 nm 波長處測定單支樣品溶液吸光度值，并與10 支樣品溶液吸光度的平均值比較。按原國家食品藥品監督管理局《化學藥品地方標準上升國家標準：第16 冊》及多版CTP注射液標準（YBH20032004，YBH24642005，YBH36782005，YBH39322005，YBH07902006，YBH18242006）對 注 射用三磷酸胞苷二鈉的含量均勻度進行測定，7廠家29批樣品均低于±15%限度值，全部合格。由于CTP 降解生成CDP 和CMP，有效基團并未發生改變，降解產物依然具有紫外吸收，故紫外- 可見分光光度法測定制劑時專屬性差，且結果判定范圍過于寬泛，并不能有效控制制劑質量。本研究中建立了以胞苷為對照品的高效液相色譜（HPLC）法測定含量均勻度，并參考2020年版《中國藥典（四部）》通則0941要求，以A+2.2S≤15.0 為判定標準［3］，考察市售注射用三磷酸胞苷二鈉含量均勻度的整體情況。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV - 2450 型紫外分光光度計，LC - 20AT 型高效液相色譜儀（包括SPD - M20A 型二極管陣列檢測器、Shimadzu LC - Solution 色譜工作站），均購自日本Shimadzu公司。

1.2 試藥

注射用三磷酸胞苷二鈉（國家評價性抽驗樣品，來自7 個廠家，共29 批）；CTP 對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為140758 - 201101，含量92.90%）；胞苷對照品（美國Sigma 公司，批號為BCBV5023，含量99.9%）；四丁基溴化銨為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.02 mol/ L 磷酸鹽緩沖液（稱取磷酸二氫鈉3.58 g，磷酸二氫鉀1.36 g，加水900 mL 使溶解，調pH至7.0，加入四丁基溴化銨1 g，加水定容至1 000 mL）-乙腈（90∶10，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：271 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

稱取CTP對照品20 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用流動相溶解并定容，得質量濃度為0.4 mg/mL 的CTP 對照品溶液。稱取胞苷對照品20 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，用流動相溶解并定容，搖勻，即得質量濃度為0.2 mg/mL 的胞苷對照品溶液。取樣品適量，每支用流動相溶解并轉移至50 mL（規格為20 mg）或100 mL（規格為40 mg）容量瓶中，用流動相定容，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：取2.2 項下CTP 對照溶液適量（水浴1 h），以及胞苷對照品溶液和供試品溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。理論板數按CTP 峰計應不低于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。詳見圖1。

1.CMP 2.CDP 3.CTP 4. 未知雜質A.CTP對照品溶液 B. 胞苷對照品溶液 C. 供試品溶液圖1 高效液相色譜圖1.CMP 2.CDP 3.CTP 4.Unknown impurityA.Reference solution of CTP B.Reference solution of cytidine C.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：取CTP 對照品適量，精密稱定，用流動相制成系列對照品溶液。按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以CTP質量濃度（X，mg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=17 256 815X+ 94 796（r= 0.999 9）。結果表明，CTP 質量濃度在0.019 11～1.910 95 mg/mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

進樣精密度試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果的RSD為0.05%（n=6），表明方法精密度良好。

加樣回收試驗：取已知含量（92.60%）的樣品適量，共9 份，分別加入低、中、高質量濃度的CTP 對照品溶液，按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 以胞苷為對照品計算核正因子

標準曲線斜率比值：稱取胞苷對照品4.86，9.18，13.17，19.30，24.65 mg，精密稱定，分別置100 mL 容量瓶中，用流動相溶解并定容，作為胞苷對照品系列溶液。取CTP對照品5.63，12.00，14.37，19.96，25.80 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用流動相溶解并定容，作為CTP 對照品系列溶液。按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（X，mg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得胞苷和CTP回歸方程分別為Y1=33 519 577X1+548 544（r>0.998）和Y2= 15 452 159X2+ 45 500（r> 0.998）。質量濃度相同時，胞苷與CTP的峰面積之比（K胞/KCTP）為2.169。

胞苷吸收系數測定：取胞苷對照品溶液與相同濃度CTP對照品溶液，以流動相為稀釋劑，于200～400 nm波長范圍內掃描紫外光譜圖，狹縫寬度為1.0 nm，得到胞苷和CTP 最大吸收波長均為271 nm。取胞苷對照品溶液與CTP 對照品溶液，分別以紫外分光光度計測定271 nm 波長處吸光度值，并用最大值計算吸收系數（E）。結果胞苷吸收系數為375.7，CTP 吸收系數為172.4，兩者吸收系數比值為2.179。

2.5 樣品含量均勻度測定

取29 批樣品各適量，分別按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積，以胞苷為對照品的外標法，采用2.167 為折算系數計算樣品含量均勻度。并與法定檢驗方法［3］結果比較。結果見表2。

表2 各生產廠家樣品含量均勻度測定結果Tab.2 Determination results of uniformity of dosage unit of samples from different manufacturers

3 討論

根據批準文號信息，多數生產廠家采用紙電泳法測定含量，含量均勻度采用紫外分光光度法在280 nm波長處測定吸光度值，計算10支樣品吸光度值的偏差。紫外分光光度法測定的吸光度值不能反映CTP 主成分降解情況，即不能準確測定藥物制劑的含量均勻度。根據本課題組前期已優化好的色譜條件及文獻［4 - 5］，本研究中采用了2種確定校正因子的測定方法：質量濃度相同時胞苷與CTP 的峰面積之比為2.169；紫外吸收系數之比為2.179，這兩種方法與CTP 的質量比的經典公式中的2.167（CTP 相對分子質量與胞苷相對分子質量比值MCTP/M胞= 527.1/ 243.2 = 2.167）標準差≤0.5%。考慮到HPLC 法及紫外分光光度法測定結果存在一定誤差，計算過程中折算系數采用質量比公式中的2.167。本研究中建立了以胞苷為對照品，以2.167為折算系數的外標法，考察了國家評價性抽驗中注射用三磷酸胞苷二鈉的含量均勻度。

注射用三磷酸胞苷二鈉由于熱不穩定等原因，結合市場藥品實際情況，目前現行標準未對含量測定設置上限，企業存在多投料，以規避產品降解后含量測定不合格的風險。按照2020 年版《中國藥典（四部）》判定含量均勻度結果，A+ 2.2S，其中A值可以對目前市場上高投料的情況進行控制，2.2S值可對同一批樣品中每瓶的均質程度進行控制。裝量差異或紫外分光光度法均無法對主成分的均勻性進行考察，均為間接測定產品符合標示量程度的指標。

另有企業采用HPLC 法根據經典公式計算CTP 的質量比（%），再結合紫外分光光度法測定總核苷酸，最終通過計算得到含量［6］。該方法采用HPLC 和紫外兩步測定，易造成系統誤差；還有一種試行標準以CTP 為對照品的外標法測定，CTP 對照品具有較強的引濕性，并對溫度敏感，需低溫保存，易發生降解。以胞苷為對照品，不僅可準確測定樣品中主成分的含量，同時，在后期研究中，可準確地測定有關物質中CTP 的降解情況，便于對其他雜質的控制。

綜上所述，現行藥品質量標準中含量均勻度測定項存在一定問題。以胞苷為對照品的HPLC 法測定注射用三磷酸胞苷二鈉含量均勻度，方法更科學、更準確，能更好地控制產品質量。