氫核磁共振定量法測定伊立替康中間體含量*

毛聯(lián)崗，程青芳

（1. 連云港杰瑞藥業(yè)有限公司，江蘇 連云港 222000； 2. 江蘇海洋大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 連云港 222005）

鹽酸伊立替康屬半合成水溶性喜樹堿類拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑，主要用于治療晚期大腸癌、小細(xì)胞肺癌、胃癌、宮頸癌等［1-3］。文獻(xiàn)報(bào)道的鹽酸伊立替康的合成路線較多，代表工藝是通過鹽酸1-氯甲酰基-4-哌啶基哌啶和7-乙基-10-羥喜樹堿縮合生成伊立替康，再在水中與濃鹽酸成鹽［4-6］。因此，鹽酸1-氯甲酰基- 4 - 哌啶基哌啶是鹽酸伊立替康合成過程中重要的中間體，其含量直接影響原料藥的質(zhì)量。由于鹽酸1 - 氯甲酰基- 4- 哌啶基哌啶結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，且紫外吸收很弱，目前尚無化合物的檢測方法報(bào)道，制藥企業(yè)中采用較多的是滴定法和氣相色譜（GC）法。滴定法的突變終點(diǎn)較模糊，專屬性差。GC法測定時(shí)由于樣品分子本身含有鹽酸鹽，沸點(diǎn)較高，汽化不完全，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，且缺少標(biāo)準(zhǔn)對照品，導(dǎo)致測定結(jié)果欠準(zhǔn)確。氫核磁共振定量法（qNMR）具有簡便、快速、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣、不破壞樣品、無需標(biāo)準(zhǔn)對照品等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域［7-14］。目前，qNMR 法已作為一種測定藥物絕對含量的方法先后被美國藥典、英國藥典、歐洲藥典、日本藥局方和中國藥典等作為法定標(biāo)準(zhǔn)收錄。本研究中在課題組前期工作［15］的基礎(chǔ)上對內(nèi)標(biāo)、核磁參數(shù)、氘代溶劑等因素進(jìn)行考察，建立了測定鹽酸1 - 氯甲酰基- 4 - 哌啶基哌啶含量的qNMR 法。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Bruker Avance ⅢHD 型500 MHz 核磁共振譜儀（Topspin 3.2操作軟件，瑞士Bruker公司）；XS105 DU型微量分析電子天平（感量為0.01 mg，瑞士Mettler Toledo公司）；Agilent 7890A 型氣相色譜儀（美國Agilent Tech?nologies Inc. 公司）。

1.2 試藥

1 - 氯甲酰基- 4 - 哌啶基哌啶鹽酸鹽（連云港杰瑞藥業(yè)有限公司，批號分別為20200513，20190403，20190501，20190602）；鹽酸吉西他濱對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100622 - 201903，含量99.9%）；氘代二甲基亞砜（DMSO-d6，美國劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室，氘代度為99.8%）；重水（D2O，上海思域化工科技有限公司，氘代度為99.9%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

采用zg30 脈沖序列，測試1H-NMR。參數(shù)設(shè)置，脈沖寬度（PW）9.42 μs；測定溫度（T）22 ℃，激發(fā)脈沖角度（θ）30°，采樣次數(shù)（NS）32次，脈沖延遲時(shí)間（D1）20 s，采樣時(shí)間（AQ）3.276 8 s，掃描寬度（SW）10 000 Hz，時(shí)間域數(shù)據(jù)點(diǎn)（TD）-209.5 ℃，線寬因子（LB）0.3 Hz，觀測頻率500.11 MHz。

2.2 溶液制備

取待測樣品8.9 mg 和內(nèi)標(biāo)鹽酸吉西他濱10.0 mg，精密稱定，置不同或同一離心管中，加入0.6 mL D2O，振蕩溶解，即得供試品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，以及混合溶液。各平行制備3份。

2.3 數(shù)據(jù)處理

在上述試驗(yàn)條件下，調(diào)整儀器參數(shù)，勻場，采樣。對得到的圖譜采用手動方式進(jìn)行基線校正、相位調(diào)整以及化學(xué)位移校正。校正后的圖譜信號均為正信號，定量信號峰左右對稱，基線平滑且向信號峰過渡自然，定量峰與該物質(zhì)的其他峰積分比例較好。同一圖譜，根據(jù)樣品和內(nèi)標(biāo)定量峰的積分范圍分別進(jìn)行積分，各積分3次，當(dāng)RSD小于1%時(shí)，取平均值。根據(jù)積分結(jié)果按如下絕對定量公式計(jì)算待測樣品的含量。

式中，As和Ar分別為待測樣品和內(nèi)標(biāo)定量峰的積分面積；ns和nr分別為待測樣品和內(nèi)標(biāo)定量峰包含的質(zhì)子數(shù)；Ms和Mr分別為待測樣品和內(nèi)標(biāo)的相對分子質(zhì)量；ms和mr分別為待測樣品和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量；ωs和ωr分別為被測樣品和內(nèi)標(biāo)的含量。

2.4 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下供試品溶液、內(nèi)標(biāo)溶液及混合溶液各適量，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄1H-NMR 譜圖。結(jié)果待測樣品與內(nèi)標(biāo)的化學(xué)位移峰基本無重疊，定量峰能完全分離，互不干擾，表明該方法的專屬性較好。詳見圖1。

線性關(guān)系考察：在定量1H - NMR 試驗(yàn)中，參數(shù)設(shè)置合理時(shí)，各質(zhì)子吸收峰的面積與其包含的質(zhì)子數(shù)目呈正相關(guān)。為進(jìn)一步考察測試條件的影響，考察了待測樣品的線性范圍。分別稱取待測樣品4.58，9.10，10.70，12.48，14.42，17.16 mg，精密稱定，置核磁管中，各加入內(nèi)標(biāo)10.0 mg，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄1H - NMR 譜。以待測樣品與內(nèi)標(biāo)的物質(zhì)的量比（X，ns/nr）為橫坐標(biāo)，以待測樣品與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（Y，As/Ar）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.087 4X+0.052，r =0.997 3（n= 6）。結(jié)果表明，待測樣品與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的量比在0.510 6～1.916 9 范圍內(nèi)與待測樣品與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄1H - NMR 譜并積分，計(jì)算定量峰與內(nèi)標(biāo)峰峰面積的比值。結(jié)果的RSD為0.23%（n=6），表明方法精密度良好。

注：定量峰標(biāo)記為a′，a，b，c。A. 供試品溶液 B. 內(nèi)標(biāo)溶液 C. 混合溶液圖1 代表性的氫核磁共振譜圖Note：Quantitative peaks are marked as a′，a，b and c.A.Test solution B.Internal standard solution C.Mixed solutionFig.1 Representative HNMR spectrums

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液（批號為20200513）適量，分別于室溫下放置0，4，6，8，10，16，24 h時(shí)按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄1H - NMR 譜并積分，計(jì)算定量峰與內(nèi)標(biāo)峰峰面積的比值。結(jié)果的RSD為0.53%（n=7），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：稱取樣品（批號為20200513）適量，精密稱定，各6 份，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄1H-NMR 譜并積分，計(jì)算定量峰與內(nèi)標(biāo)峰峰面積的比值及樣品含量。結(jié)果的RSD為0.50%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.5 樣品含量測定

取樣品適量，分別按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，平行測定3 次，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，記錄1H - NMR 譜并積分，計(jì)算定量峰與內(nèi)標(biāo)峰峰面積的比值及樣品含量。以δ2.38（d，2H）處信號峰為待測樣品的定量峰，δ7.99（d，1H），δ6.26（d，1H），δ6.21（t，1H）處信號峰為內(nèi)標(biāo)的定量峰。結(jié)果見表1。

表1 樣品含量測定結(jié)果（n=3）Tab.1 Results of content determination of samples（n=3）

2.6 qNMR 法與質(zhì)量平衡法測定結(jié)果比較

采用企業(yè)的GC法測定樣品（批號分別為20190403，20190501，20190602）中鹽酸1-氯甲酰基-4-哌啶基哌啶的含量，結(jié)果分別為98.41%，98.17%，98.39%，干燥失重法測定的結(jié)果分別為0.21%，0.29%，0.36%，熾灼殘?jiān)y定的結(jié)果分別為0.11%，0.18%，0.15%。根據(jù)質(zhì)量平衡法，1 - 氯甲酰基- 4 - 哌啶基哌啶鹽酸鹽含量=（100%-干燥失重-熾灼殘?jiān)罣C純度，結(jié)果顯示，質(zhì)量平衡法測定3 批樣品中1 - 氯甲酰基- 4 -哌啶基哌啶鹽酸鹽含量分別為98.09%，97.70%，97.88%，與qNMR法測定的結(jié)果較接近。

3 討論

3.1 內(nèi)標(biāo)物與氘代溶劑選擇

待測樣品的信號峰在δ1.3～3.7之間，選擇鹽酸吉西他濱為內(nèi)標(biāo)時(shí)，內(nèi)標(biāo)的信號峰在δ3.8～8 之間，兩者的信號峰基本無重疊；混合溶液譜圖的化學(xué)位移峰峰形簡單清晰且基本無重疊，達(dá)到核磁定量的要求。此外，待測樣品和內(nèi)標(biāo)的相對分子質(zhì)量較接近，稱樣量接近，可減少稱量誤差，能較好地滿足定量要求。故選擇鹽酸吉西他濱為內(nèi)標(biāo)物。

核磁定量法測定樣品含量的首要條件是待測樣品和內(nèi)標(biāo)能在合適的氘代溶劑中具有良好的溶解性且其殘留信號峰對定量峰無干擾。預(yù)試驗(yàn)中參考文獻(xiàn)［15］，以0.5 mL DMSO和0.5 mL D2O的混合物作為氘代溶劑，結(jié)果待測樣品在該混合試劑中溶解性較差，需加熱或超聲才能使其完全溶解，這可能會影響測定結(jié)果；當(dāng)采用0.6 mL D2O為溶劑時(shí)，發(fā)現(xiàn)待測物和內(nèi)標(biāo)物的溶解性均很好，且D2O還能消除樣品中活潑質(zhì)子的干擾，保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。故最終確定以0.6 mL D2O為氘代溶劑。

3.2 NMR 試驗(yàn)參數(shù)選擇

脈沖延遲時(shí)間（D1）：D1是積分信號強(qiáng)度的主要影響因素之一。若D1較短，則樣品和內(nèi)標(biāo)中的質(zhì)子無法完全弛豫，相應(yīng)峰面積的比值會產(chǎn)生偏差，導(dǎo)致定量測定結(jié)果的誤差。本研究中考察了D1對結(jié)果的影響，將D1分別設(shè)置為5 s，10 s，20 s，40 s，80 s 進(jìn)行NMR 測定。結(jié)果表明，樣品及內(nèi)標(biāo)定量峰的積分面積在D1=20 s后不再發(fā)生明顯變化，故選擇D1為20 s。

采樣次數(shù)（NS）：NS 增大，NMR 信號信噪比（S/N）隨之增大，試驗(yàn)時(shí)間也會延長。考察了NS 對結(jié)果的影響，將NS 分別設(shè)置為4，8，16，32，64，128 次進(jìn)行NMR測定。結(jié)果表明，樣品及內(nèi)標(biāo)定量峰的S/N在NS = 32后不再發(fā)生明顯變化，故選擇NS為32。

定量峰：定量峰的選擇直接影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。待測樣品在δ2.38處的峰為清晰的2個(gè)質(zhì)子的二重峰，峰形簡單、相對獨(dú)立，與內(nèi)標(biāo)物的核磁信號峰無重疊，故選擇δ2.38（d，2H）處的峰為待測樣品的定量峰。在內(nèi)標(biāo)物的核磁信號峰中，在δ7.99和δ6.26處的峰各為1 個(gè)質(zhì)子的清晰的二重峰，在δ6.21處的峰為清晰的1 個(gè)質(zhì)子的三重峰，一般選擇定量峰的原則是峰形相近，包含質(zhì)子數(shù)相近，信號無干擾。δ7.99（d，1H），δ6.26（d，1H）這兩組峰的峰形及包含的質(zhì)子數(shù)均與待測樣品的定量峰相近，且信號之間無干擾，可以選擇這兩組信號峰為內(nèi)標(biāo)的定量峰，但由于δ6.21（t，1H）與δ6.26（d，1H）處的峰峰形雖清晰，但峰位較接近，故為了盡可能消除干擾，將δ7.99（d，1H），δ6.26（d，1H），δ6.21（t，1H）處的3組信號峰選為內(nèi)標(biāo)的定量峰。

3.3 方法評價(jià)

本研究中建立的測定鹽酸1-氯甲酰基-4-哌啶基哌啶含量的qNMR法以鹽酸吉西他濱為內(nèi)標(biāo)，專屬性強(qiáng)，線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性等均較好，分析效率較高。以該法測定的3 批1 - 氯甲酰基- 4 - 哌啶基哌啶鹽酸鹽含量結(jié)果均與質(zhì)量平衡法接近。由于鹽酸1-氯甲酰基-4-哌啶基哌啶具有紫外吸收弱和不穩(wěn)定性等自身化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，采用qNMR測定其含量可克服企業(yè)常規(guī)的滴定法和色譜含量測定法的缺陷并形成有效的補(bǔ)充，為建立鹽酸伊立替康中間體的質(zhì)量控制新方法提供參考。