靈芝菌絲毒理學安全性評價研究

孫國強，董金穎，曹發昊

（1.山西瑞芝生物科技有限公司，山西 運城 044000；2.運城學院，山西 運城 044000）

靈芝（Ganoderma lucidum）也叫瑞草、仙草等，為名貴的藥用真菌[1]。現代醫學表明，靈芝具有調節免疫力、抗腫瘤、抗衰老、保肝和提高機體缺氧耐受力等活性[2-7]。目前，靈芝子實體和孢子主要作為保健食品應用，但不管是野生采摘還是人工栽培的靈芝都極易受自然條件限制，生產效率低，產品質量波動大，生產規模遠不能滿足市場需求[8]。近年來，采用液態發酵技術生產靈芝菌絲，實現了規?；慨a，成為解決上述問題的重要途徑[9]。研究表明，靈芝菌絲與子實體的營養成分十分相似，對人體同樣有功效作用[10]。

目前，國內外針對靈芝子實體和靈芝孢子及其產品的毒理學安全性評價研究已經開展了很多[11-17]，但針對菌絲的相關報道很少[18-19]，其作為食品應用的毒理學研究不夠深入，尚缺安全性評價數據支持。將靈芝菌絲作為原料加工成食品，可有效增加靈芝的附加值，產生較大的經濟和社會價值，因此開展其毒理學安全性評價試驗尤為重要。本研究較系統地對靈芝菌絲的急性毒性、遺傳毒性等進行了研究，以期為靈芝菌絲的安全食用提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試品

靈芝菌絲粉，由山西瑞芝生物科技有限公司培養靈芝菌絲，經干燥、粉碎制得，該供試樣品為棕色粉末，置密閉、陰涼干燥處儲存。推薦成人服用量為3.0 g/（60 kg·d）。

1.2 動物

SD 大鼠和ICR 小鼠由上海斯萊克試驗動物有限責任公司提供，試驗動物生產許可證號為SCXK(滬)2012-0002。試驗動物飼料由浙江省試驗動物中心提供，執行標準為GB 14924.1—2001。試驗動物使用許可證號為SYXK(浙)2013-0190，試驗動物室溫度為20 ～24 ℃，相對濕度為40%～70%。

1.3 儀器與試劑

超凈工作臺（上海博迅實業有限公司）；生物顯微鏡（深圳盛天儀器有限公司）；7180 型全自動生化分析儀[日立（中國）有限公司]；XT-1800i 型全自動血細胞分析儀（日本SYSMEX 株式會社）。

環磷酰胺CTX（上海華聯制藥公司）；絲裂霉素C（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司）；疊氮鈉（NaN3）、1,8二羥基蒽醌、2-AF、柔毛霉素、ICR-191（Sigma公司）。多氯聯苯誘導制備大鼠肝S9，經2-AF 和1,8-二羥基蒽醌測試具有生物活性，冷凍保存。TA97、TA98、TA100、TA1024 種鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養缺陷型菌株由上海疾病預防控制中心毒理科提供，經生物學鑒定合格后用于試驗。

1.4 急性經口毒性試驗方法

1.4.1 大鼠急性經口毒性試驗

選擇最大耐受劑量法進行大鼠急性經口毒性試驗。選20 只體重180 ～220 g 的SD 大鼠，雌雄各10 只。染毒前，禁食過夜但不限制飲水。設20 g·kg-1體重一個劑量組（相當于推薦人服用量的400 倍），采用經口灌胃方式，將靈芝菌絲粉碎后稱取100 g 加去離子水至200 mL 配成0.50 g·mL-1（最大可灌胃濃度），按20 mL·kg-1體重，灌胃2 次，每次間隔4 h。染毒后觀察小鼠的一般情況、中毒癥狀和死亡情況，觀察期限2 周。

1.4.2 小鼠急性經口毒性試驗

選擇最大耐受劑量法進行小鼠急性經口毒性試驗。選20 只18 ～22 g 體重的ICR 小鼠，雌雄各10 只。染毒前，禁食過夜但不限制飲水。設20 g·kg-1體重一個劑量組（相當于推薦人服用量的400 倍）。用經口灌胃方式，將靈芝菌絲粉碎后稱取100 g 加去離子水至200 mL 配成0.50 g·mL-1（最大可灌胃濃度），按20 mL·kg-1體重，灌胃2 次，每次間隔4 h。染毒后觀察小鼠的一般情況、中毒癥狀和死亡情況，觀察期限2 周。

1.5 遺傳毒性試驗方法

1.5.1 Ames 試驗

試驗選用經生物學鑒定為合格的TA97、TA98、TA100、TA1024 種鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養缺陷型菌株。采用平板摻入法，選擇5 000 μg/皿為最高劑量。稱取靈芝菌絲1.0 g 加去離子水至20 mL，充分混勻，配成50 000 μg·mL-1，用去離子水依次5 倍稀 釋 成80 μg·mL-1、400 μg·mL-1、2 000 μg·mL-1、 10 000 μg·mL-1，各濃度均經121 ℃、20 min 濕熱滅菌后用于試驗。每個培養皿加0.1 mL，即劑量分別為8 μg/ 皿、40 μg/ 皿、200 μg/ 皿、1 000 μg/ 皿、5 000 μg/皿。同時設有空白對照組、溶劑（H2O）對照組及陽性對照組（ICR-191、2-AF、絲裂霉素C、NaN3、柔毛霉素、1,8-二羥基蒽醌），各種菌株每個測試濃度設3 個平行皿，在加、不加S9兩種條件下試驗，重復測試一次。直接計數各培養基上菌株的回變菌落數。

1.5.2 小鼠骨髓細胞微核試驗

采用間隔24 h 二次給予樣品進行小鼠骨髓細胞微核試驗。25 ～30 g 體重的50 只ICR 小鼠，隨機分為5 組，每組雌、雄各5 只。設3 個劑量組 2.5 g·kg-1、5.0 g·kg-1、10.0 g·kg-1體重（分別相當于推薦人服用量的50、100 和200 倍），用去離子水配制。并設陰性對照、陽性對照組（CTX 0.06 g·kg-1）， 3 個劑量組分別稱取靈芝菌絲25 g、50 g、100 g，然后分別加去離子水至200 mL 配成0.125 g·mL-1、 0.250 g·mL-1、0.500 g·mL-1的試樣，再按20 mL·kg-1灌胃；對照組也作相同處理。以最后一次給靈芝菌絲后計時6 h，處死小鼠后再取其股骨骨髓制片，用甲醇固定Giemsa 染色后再進行鏡檢，每只小鼠計數PCE（嗜多染紅細胞）1 000 個來計算微核率。

1.5.3 小鼠精子畸形試驗

選50 只25 ～35 g 體重的ICR 小鼠，每組雌、雄各5 只，隨機分成5 組。設3 個劑量組2.5 g·kg-1、 5.0 g·kg-1、10.0 g·kg-1體重（分別相當于推薦人服用量的50、100 和200 倍），用去離子水配制。另設陰性對照、陽性對照組（絲裂霉素C 0.002 g·kg-1）。 3 個劑量組分別稱取靈芝菌絲25 g、50 g 和100 g， 然后加去離子水至200 mL 配成0.125 g·mL-1、 0.250 g·mL-1、0.500 g·mL-1的試樣，再按20 mL·kg-1連續灌胃5 d；對照組也作相同處理。在首次給試樣的第35 天以頸椎脫臼法處死小鼠，將每組的各只小鼠兩側附睪取下，放入已加入適量生理鹽水的平皿，附睪用剪刀剪碎后用4 層擦鏡紙吸濾，涂片后自然干燥，再用甲醇固定后以1%伊紅進行染色。高倍鏡下檢查精子形態，每只小鼠查看1 000 個完整精子，記錄畸變精子類型和數目，計算畸形率。

1.6 大鼠30 d 喂養試驗

選80 只50 ～70 g 體重的SD 大鼠，每組雌雄各10 只，隨機分為4 組。大鼠自由進食和飲水采用單籠飼養。設3 個劑量組和1 個陰性對照組，高、中、低3個劑量分別為5.00 g·kg-1、2.50 g·kg-1、 1.25 g·kg-1，相當于推薦人服用量的100、50 和25 倍。試驗以給予飼料喂養的方式，按體重的10%折算靈芝菌絲用量，采用逐級放大方式充分均勻拌入各個劑量組的基礎飼料中，各劑量均制作20 kg 加藥飼料。高、中、低3 個劑量組靈芝菌絲加入量為1 000 g、500 g、250 g：干酪素加入量為200 g、100 g、50 g。高、中、低3 個劑量組靈芝菌絲分別占飼料的5.0%、2.5%、1.25%。連續觀察30 d，每周記體重1 次、進食量2 次，核算食物利用率。試驗末期即第4 周，稱體重后禁食過夜，次日在空腹稱體重后從頸靜脈取血進行血液學和血生化指標檢測。大體解剖所有大鼠，將肝、腎、脾、睪丸（卵巢）稱重，計算其臟體比。同時，對臟器進行病理組織學檢查。

1.7 統計學方法

試驗數據采用SPSS 11.5 進行統計分析，數據采用“X—±S”樣式。先對數據進行方差齊性檢驗，方差齊時選用單因素方差分析法進行總體比較，若存在差異，再與對照組的試驗數據進行均數間的兩兩相比；原始數據不滿足方差齊性時，可選用秩和檢驗。

2 結果與分析

2.1 急性經口毒性試驗結果

2.1.1 大鼠急性經口毒性試驗結果

從表1 可以看出，染毒后觀察期內大鼠未出現中毒癥狀和死亡。該靈芝菌絲的雌、雄兩性別急性經口最大耐受劑量均＞20 g·kg-1體重，屬無毒級。

表1 大鼠急性經口毒性試驗結果

2.1.2 小鼠急性經口毒性試驗結果

從表2 可以看出，染毒后觀察期間試驗小鼠未出現中毒癥狀，也無死亡。該靈芝菌絲的雌、雄兩性別的急性經口最大耐受劑量均＞20 g·kg-1體重，屬無毒級。

表2 小鼠急性經口毒性試驗結果

2.2 遺傳毒性試驗結果

2.2.1 Ames 試驗結果

從表3、表4 可見，在加不加S9兩種條件下，靈芝菌絲各個劑量的回變菌落數都未超過空白對照組和溶劑對照組的2 倍，再者各劑量組別之間無明顯的劑量反應關系，該靈芝菌絲細菌回復突變試驗的結果為陰性。

表3 第一次Ames 試驗結果

表4 第二次Ames 試驗結果

2.2.2 小鼠骨髓細胞微核試驗結果

從表5 可以看出，各個劑量組的嗜多染紅細胞（Polychromatic Erythrocyte，PCE）與紅細胞（Red Blood Cell，RBC）總數的比值（PCE/RBC）均不少于對照組的20%，因而不具有骨髓抑制作用。再用泊松檢驗法統計，比較各劑量組與陰性對照組的微核率，差異無顯著性（P＞0.05），表明靈芝菌絲哺乳動物紅細胞微核試驗的結果是陰性的。

表5 小鼠骨髓細胞微核試驗結果

2.2.3 小鼠精子畸形試驗結果

從表6 可以看出，采用秩和檢驗統計分析，比較各劑量組和陰性對照組的精子畸形率，均無顯著性差異（P＞0.05），說明靈芝菌絲小鼠精子畸形試驗的結果為陰性。

表6 小鼠精子畸形試驗結果

2.3 大鼠30 d 喂養試驗結果

以1.25 g·kg-1、2.50 g·kg-1和5.00 g·kg-1劑量（相當于推薦人服用量的25、50 和100 倍）的樣品連續喂養大鼠30 d，試驗期間各組大鼠均沒有出現異常癥狀和體征，也無死亡。

2.3.1 對大鼠體重、周進食量、食物利用率的影響從表7、表8、表9 可以看出，比較高、中、低三劑量組與陰性對照組的大鼠體重、周進食量、總進食量、食物利用率以及體重增重量，經方差分析或秩和檢驗均無顯著性差異（P＞0.05）。

表7 靈芝菌絲對大鼠體重的影響

表8 靈芝菌絲對大鼠周進食量的影響

表9 靈芝菌絲對大鼠食物利用率的影響

2.3.2 對大鼠血液學指標的影響

從表10、表11 可以看出，比較各劑量組與陰性對照組大鼠的白細胞數、紅細胞數、血紅蛋白、淋巴細胞、單核細胞和粒細胞，經方差分析或秩和檢驗均無顯著性差異（P＞0.05）。

表10 靈芝菌絲對大鼠白細胞數、紅細胞數、血紅蛋白的影響

2.3.3 對大鼠血生化指標的影響

從表12、表13 可以看出，比較各劑量組與陰性對照組大鼠的血清谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、尿素氮、肌酐、甘油三酯、總膽固醇、總蛋白、白蛋白、球蛋白、白蛋白/球蛋白和血糖，經方差分析或秩和檢驗均無顯著性差異（P＞0.05）。

表12 靈芝菌絲對大鼠丙轉氨酶、谷草轉氨酶、尿素氮、肌酐、甘油三酯和總膽固醇的影響

表13 靈芝菌絲對大鼠總蛋白、白蛋白、球蛋白、白/球比和血糖的影響

2.3.4 對大鼠臟器重和臟體比的影響

從表14、表15 可以看出，比較各個劑量組與陰性對照組大鼠的肝、腎、脾、睪丸（卵巢）重、各臟體比[肝/體、腎/體、脾/體、睪丸（卵巢）/體]，經方差分析或秩和檢驗均無顯著性差異（P＞0.05）。

表14 靈芝菌絲對大鼠肝、腎、脾、睪丸（卵巢）重的影響

表15 靈芝菌絲對大鼠周臟體比的影響

2.3.5 大鼠病理組織學檢查結果

從表16 可以看出，大體解剖未見明顯異常，各臟器的組織學改變多為散發，陰性對照組和高劑量組中差別不明顯，所以可判斷各臟器的改變與靈芝菌絲的作用無直接因果關系。

表16 靈芝菌絲病理學組織觀察結果 （單位：只）

（續表16）

3 結論

參照國家相關法規[20-21]和相關文獻[22-24]，對靈芝菌絲進行了毒理學安全性評價研究。試驗結果表明，當靈芝菌絲以最大給藥量20 g·kg-1（相當于人推薦服用劑量的400 倍）經口方式給小鼠灌胃后，小鼠沒有出現中毒癥狀及死亡，急性經口毒性為無毒。3項遺傳毒性試驗的結果也都是陰性。大鼠30 d 喂養試驗，以5.00 g·kg-1、2.50 g·kg-1、1.25 g·kg-1劑量（分別相當于推薦人體用量的100、50、25 倍）的樣品 30 d 連續喂養大鼠，所有大鼠試驗期內均未見異常癥狀和體征，也無死亡。所有大鼠的體重、體重增重、周進食量、總進食量、食物利用率、血常規和血液生化指標、臟器重及臟體比等都未發生明顯變化；經大體解剖和組織病理學檢查，所有大鼠均未出現與靈芝菌絲有關的異常變化，表明靈芝菌絲30 d 喂養對大鼠未產生毒副作用。上述結論表明，靈芝菌絲具備無遺傳毒性、無致突變性的特點，本研究為靈芝菌絲產品的開發提供了科學依據，對推動靈芝產業的發展有積極意義。