秦薯5號甘薯莖尖分生組織培養脫毒及種苗快繁技術研究

秦靜遠, 朱渭兵

(1.楊凌職業技術學院,陜西 楊凌 712100;2.楊凌金薯種業科技有限公司, 陜西 楊凌 712100)

甘薯[Ipomoeabatatas(L.)Lam.]屬于旋花科甘薯屬，是甘薯屬的一個栽培種，在中國種植分布廣泛。進入21世紀，中國甘薯種植面積常年在5×106hm2左右，是我國重要的糧食、飼料作物和工業原料[1]。秦薯5號是寶雞市農業科學研究院與西北農林科技大學聯合選育，為優質鮮食蒸烤和淀粉加工兼用型甘薯品種。薯塊干物率33.08%，淀粉含量69.14%(干基)，粗蛋白1.11%(鮮薯)，可溶性糖5.03%。秦薯5號在陜西省內常年種植面積約4萬hm2，約占全省甘薯種植面積的50%，為本省甘薯主栽品種[2]。甘薯屬無性繁殖作物，主要通過塊根、莖蔓、秧苗進行繁殖。在生產中，甘薯病毒病是影響甘薯產量和品質的主要因素之一。近年來危害重的病害SPVD是由甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)和甘薯褪綠矮化病毒(SPCSV)雙重感染和協同互作引起[3]，顯癥植株的產量比健康植株減少79%～86%，嚴重影響產量和經濟效益，對甘薯種苗生產和產業發展危害較大。筆者研究利用莖尖分生組織培養技術繁育秦薯5號脫去SPVD 2種病毒的脫毒種苗，以提高甘薯產量和品質。

1 材料與方法

1.1 供試品種為秦薯5號甘薯

種薯由楊凌金薯種業科技有限公司甘薯種苗繁育基地提供。挑選特性完全符合秦薯5號的塊根，清洗干凈，浸蘸0.1%的甲基托布津溶液，種植于經高溫滅菌的泥炭與珍珠巖(2∶1)混合基質中，設置溫度為28℃催芽，出芽后設置溫度為38℃16 h，27℃8 h。處理10 d后切取2 cm長莖稍，剪去葉片，自來水沖洗30 min，經75%酒精浸泡10～15 s，有效氯濃度為2%NaClO溶液(150 mL加1滴洗潔精)浸泡滅菌20 min，無菌水沖洗3次后，浸在無菌水中備用。

1.2 莖尖剝離與培養

在超凈工作臺上，用無菌濾紙吸去材料表面水分，置于體視顯微鏡下，用鑷子固定材料，用解剖針小心剝去頂芽外層幼葉，露出莖尖分生組織，用手術刀尖小心切取0.3～0.5 mm含有2～3個葉原基的莖尖接種到芽誘導培養基上。培養基以MS+IAA0.2 mg/L+GA30.05 mg/L+蔗糖3.0%為基礎，附加6-BA 0.1、0.2、0.5、1.0 mg/L，pH 5.8。每個培養基分15支試管，每管接1個莖尖。培養基為液體狀態，以濾紙橋方式培養，外植體放在濾紙上高出培養基液面約5 mm處。

在上述培養基上誘導出的芽分別編號，轉接至MS+NAA0.01mg/L+蔗糖3.0%+瓊脂0.6%，pH5.8的培養基上培養，待長至5～6片葉后，以1節1段轉接入相同培養基中繼續培養，進行病毒檢測和增殖培養基篩選。

各培養階段的溫度設為23±2℃，光照時間14 h/d，光強為2 000 Lx，光源為LED燈管。

1.3 病毒檢測

采用NCM—ELISA方法進行SPFMV和 SPCSV 2種甘薯病毒檢測[3]。取不同株系試管苗的葉片，研磨后將汁液點于硝酸纖維素膜上，按照試劑盒使用說明書上步驟進行操作，肉眼觀察病毒檢測結果。若樣品是陽性，會在膜上形成鮮明的色斑，陰性則沒有顏色反應。

1.4 試管苗增殖培養

試管苗以無菌短枝扦插方式繁殖。在無菌條件下，試管苗以2節1段接種在增殖培養基上。增殖培養基以MS+NAA0.05 mg/L+蔗糖3%+瓊脂0.6%，pH5.8為基礎，附加6-BA0.05、0.1、0.5、1.0、2.0 mg/L，以不加6-BA為對照。每個處理20瓶，每瓶接5個材料。28 d后測量葉片數，株高，根數，根長，生根率等生長狀態指標。

1.5 壯苗生根培養

以1/2MS+蔗糖2%+瓊脂0.6%為基礎，附加NAA，濃度分別為0.01、0.05、0.1 mg/L，以不加NAA為對照。21 d測量根長、根數等生長狀態指標。

1.6 試管苗煉苗移栽

把長有5～7片葉，根系發達試管苗的培養瓶移至人工氣候室中，打開瓶蓋，注入少量自來水，瓶中水面高于培養基1 mm左右，光照度5 000 Lx，溫度25℃，濕度85%，2 d后濕度調整為70%。4 d后洗去試管苗粘附的培養基，將試管苗栽植至泥炭與珍珠巖(2∶1)混合基質中。基質使用前，按7 00 g·m-3的用量加CaCO3調節pH，將pH由5調至6左右。

2 結果與分析

2.1 不同生長調節劑對甘薯莖尖分生組織芽誘導的影響

接種后的莖尖分生組織，1d后即有部分外植體發褐死亡，其余的繼續培養全部形成愈傷組織，沒有出現細菌和真菌污染。50d后部分愈傷組織上長出1芽，均無芽叢形成，另一部分愈傷組織無芽形成。莖尖形成的芽在愈傷組織上生長緩慢，轉切下入上述MS+NAA0.01 mg/L+蔗糖3.0%+瓊脂0.6%培養基上能較快生長。

不同生長調節劑組合對莖尖分生組織芽誘導率影響較大，在6-BA濃度在0.1～0.5 mg/L范圍時，隨著濃度提高，芽誘導率也在提高，當6-BA濃度為1.0 mg/L時，外植體形成的愈傷組織會較快增大，而芽誘導率下降。MS+6-BA0.5 mg/L+IAA0.2 mg/L+GA30.05 mg/L有利于莖尖分生組織誘導成芽(表1)。

表1 不同生長調節劑組合對甘薯莖尖分生組織芽誘導的影響

2.2 試管苗病毒檢測

采用NCM—ELISA方法進行SPFMV和 SPCSV 2種甘薯病毒檢測，各株系試管苗SPFMV,SPCSV 2種病毒檢測結果均為陰性。

2.3 不同生長調節劑組合對試管苗增殖的影響

6-BA濃度相對較低時促進試管苗生長，隨著6-BA 濃度的提高，在濃度0.5～2.0 mg/L時，秦薯5號試管苗株高增加緩慢，并在苗基部出現了愈傷組織，在6-BA 2.0 mg/L時有玻璃化苗出現。MS+6-BA0.1 mg/L +NAA0.05 mg/L適合于繼代增殖培養(表2)。在以后的增殖培養中，使用相同培養基，以2節1段的方式進行無菌短枝扦插，約30 d為1個周期，增殖系數可達5.8。

表2 不同生長調節劑組合對秦薯5號試管苗快繁的影響

2.4 不同濃度NAA對生根的影響

試管苗生根以NAA0.01 mg/L為宜，提高NAA濃度試管苗生長過快，節間過長，莖葉色淡綠，試管苗有透明趨勢。在NAA 0.1 mg/L時，在苗基部出現明顯愈傷組織，影響根的誘導和生長(表3)。

表3 不同NAA濃度對秦薯5號試管苗生根的影響

2.5 試管苗煉苗

試管苗煉苗后，洗去粘附的培養基移栽至裝有混合基質穴盤中，澆透水后噴施0.1%的普力克溶液，保溫保濕，試管苗成活率可達98%以上。

3 結果與分析

甘薯塊根經高溫催芽處理后，剝取的秦薯5號0.3～0.5 mm包含2～3個葉原基莖尖組織，在MS+6-BA0.5 mg/L+IAA0.2 mg/L+GA30.05 mg/L+蔗糖3%液體培養基上具有較高的芽誘導率。剝取的莖尖越小,成活率越低,這與Q.C.Wang研究一致[5]。每個外植體脫分化形成的愈傷組織僅能誘導出1芽，沒有形成叢生芽，這說明此芽應是外植體原有的莖尖分生組織長大而成，而不是由外植體脫分化形成的愈傷組織經再分化形成的不定芽。

在免疫定位技術的敏感范圍內，SPCSV沒有達到甘薯莖尖第5葉原基，而SPFMV在第4葉原基中可以檢測到，在更幼嫩的葉原基中不具有維管組織發育的解剖特征[6]。試驗中剝取包含2～3個葉原基的莖尖分生組織誘導形成的苗，引起SPVD病害的2種病毒SPMMV,SPCSV檢測為陰性，說明這兩種病毒沒有侵染到莖尖的第2至3葉原基。但是否會因檢測敏感范圍的影響，在以后的試管苗擴繁過程中出現病毒再次積累，則需要定期的檢測。

在脫毒試管苗增殖培養中，6-BA濃度在0.5～2.0 mg/L,時葉黃化現象會升高，這與陸展正在京薯6上的研究結果一致[4]。秦薯5號試管苗適宜在MS+6-BA0.1 mg/L+NAA0.05 mg/L+蔗糖3%+瓊脂0.6%培養基上增殖培養，繁殖倍數可達5.8，1/2MS+NAA0.01 mg/L+蔗糖2%+瓊脂0.6%培養基可誘導根的發生，且苗健壯,可以快速繁殖出大量甘薯脫毒試管苗。脫毒試管苗經煉苗后移栽至滅菌的混合基質中，保溫保濕防菌，成活率可達98%以上。