合水粉葛常見病害調查及病原菌分離鑒定

蔡永鵬劉瓊光李敏華莫道銘

(1.佛山市高明區農業技術服務推廣中心，廣東 佛山 528000；2.華南農業大學,廣東 廣州 510642)

粉葛為豆科葛屬植物，因具有較高的營養和藥用價值，在廣東、廣西、湖南、江西、福建、四川、云南等地廣泛種植。然而，粉葛有多個栽培品種，其中，佛山市高明區的合水粉葛是經國家質檢總局審批的國家地理標志產品。合水粉葛在高明種植歷史悠久，種植面積較大，作為高明的特產，合水粉葛對于地方經濟有著重要的意義。受種植環境、栽培措施等影響，病害發生越來越嚴重，有必要對粉葛的病害進行調查及病原菌分離鑒定，為生產種植過程中病害防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病害標本采集

在高明區更合鎮田間種植的粉葛，共采集218個病害標本帶回實驗室，用于病害鑒定。

1.1.2 常用培養基及緩沖液

1.1.2.1 PDA培養基

馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水定容到1L，121℃滅菌20min。

1.1.2.2 LB培養基

胰蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeast extract)5g，NaCl 10g，蒸餾水定容至1L，121℃滅菌20min。

1.1.2.3 1×TBE

54g Tris堿，27.5g硼酸，20mL0.5mol·L-1的EDTA(PH8.0)加1L水溶解，使用時稀釋5倍。

1.1.2.4 0.5mol·L-1EDTA(pH8.0)

在800mL水中加入186.1g EDTA，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調節溶液pH至8.0，然后定容至1L，分裝后高壓滅菌備用。

1.1.3 生化試劑及其他材料

Taq DNA聚合酶、dNTP、10×PCR Buffer等；DNA分子量標準DL 2000(DL2000DNAMarker)；DNA凝膠回收試劑盒；胰蛋白胨、酵母提取物(Yeast Extract)、瓊脂(Agar)、葡萄糖、蔗糖等。

1.1.4 主要儀器

超凈工作臺、恒溫培養箱、恒溫培養搖床、低溫冰箱、超純水器、滅菌鍋、PCR擴增儀、電泳儀、凝膠成像系統、電子天平、分析天平、微波爐、金屬浴等。

1.2 試驗方法

將采回的標本先在顯微鏡下觀察病原菌噴菌現象，初步確定是侵染性病害還是非侵染性病害。

1.2.1 病原真菌分離

利用組織分離法對粉葛炭疽病菌進行分離，在超凈臺中，取帶明顯病害癥狀的植物葉片和莖組織，用雙蒸水沖洗。取病健交界處的組織，用經無菌處理的手術刀裁剪成4～5mm大小的片狀物或塊狀物，用75%的酒精漂洗1min，再放到0.1%的次氯酸鈉溶液中漂洗3min。消毒后，用雙蒸水沖洗3～4次。用已滅菌的鑷子抓取消毒漂洗過的組織塊，以每皿4～5塊的數量，均勻排放在PDA平板上，放好后輕微按壓，直到培養皿倒放時不會掉落。在培養皿上用記號筆記錄相應信息。將載有組織塊的培養皿倒置在30℃恒溫培養箱中進行培養，4d后在超凈臺中，挑選培養基上未污染的菌落，用接種環在菌落邊緣挑取1小塊培養基，轉移到新的培養基上，將有菌絲的那一面朝下接觸培養基。多次重復試驗，直到僅分離出1種菌。

1.2.2 科赫氏法則驗證和致病性測定

在室內進行病原菌的致病性測定，用70%的酒精將健康粉葛莖切段進行表面消毒，并用雙蒸水沖洗3次，放置在已經進行消毒的搪瓷托盤中。在粉葛莖稈切段的表面用已滅菌的針刺小孔。選取菌落直徑已大約長至70mm的疑似病原菌的PDA培養基，在培養基最外圍真菌生長最旺盛的部分，用已滅菌的打孔器打孔，獲得約7mm的菌餅。將打孔獲得的菌餅覆蓋在粉葛莖稈切段表面的小孔上，并以空白PDA培養基作為對照。接著，每日用噴壺對粉葛莖切段表面噴灑雙蒸水，放置在30℃恒溫培養箱中，約4d后待粉葛莖切段出現發病情況，觀察并記錄是否出現與前期采集到的病株相同的癥狀。

若有發病，再從發病處取組織，對病原菌進行分離純化，觀察是否獲得同分離步驟相同的致病菌，以此完成柯赫氏法則的驗證。

1.2.3 病原真菌鑒定

1.2.3.1 形態學觀察

將經柯赫氏法則驗證后的菌株，轉移到新的PDA培養基中，在30℃恒溫培養箱中倒置培養7d，待菌落長到約70mm。對培養后的菌落外觀、菌絲和分生孢子等形態特征進行觀察，查找資料，進行形態學的鑒定，能夠初步鑒定到病原菌的屬。

1.2.3.2 分子生物學鑒定

選取經過驗證，確實為致病菌的菌株，在超凈臺中刮下茂盛的菌絲至離心管中，令菌絲質量大約為100mg，來進行菌株的DNA的提取。完成真菌DNA提取后，對獲得的DNA進行PCR擴增、序列測序和結果分析。PCR擴增體系如表1所示。

表1 PCR擴增體系

1.2.3.3 PCR反應參數

預變性94℃，5min；變性94℃，45s；退火53℃，45s；延伸72℃，1min；共35個循環。再延伸72℃，10min。擴增完將產物放入4℃冰箱中進行保存。將PCR擴增所得的DNA產物進行瓊脂糖凝膠電泳實驗，將電泳產物在凝膠成像系統中進行觀察。選取擴增條帶清晰約540bp(base pair)的目標條帶將其切下，進行凝膠回收。PCR擴增產物送到上海英駿生物技術有限公司進行測序。在DNAman軟件中拼接測序結果，在GenBank數據庫中進行序列的BLAST比對分析。

2 結果與分析

在高明區更合鎮田間種植的粉葛，共采集218個病害標本，經顯微鏡觀察，鑒定出常見的幾種真菌病害。

2.1 粉葛擬銹病

粉葛擬銹病是一種常見發生的病害。該病除了危害葉片、葉柄外，還危害葛藤，通常在葉脈和葉柄處病斑最多，發病初期先出現褪綠黃斑，嚴重時形成黃色泡狀隆起，見圖1，后期在莖上呈腫瘤狀，破裂后有黃色膿狀物質散出，受害葉片容易早落，嚴重時植株萎蔫枯死。據調查，粉葛擬銹病每年4月開始零星發生，到12月收獲期內都有發生，其發病特點是高溫干旱時發病輕，梅雨季節發病重，病害嚴重田塊，病株率達90%～100%。由葛藤集壺菌(Sychytrium puerariae)引起，見圖2。

圖1 粉葛擬銹病發病癥狀

圖2 粉葛擬銹病菌顯微鏡下觀察孢子囊形態

2.2 粉葛棒孢霉葉斑病

該病主要危害葉片、葉柄及葛藤，形成多角形或不規則形黑色病斑，見圖3，潮濕環境下，病部產生黑色霉體，即為病原菌的分生孢子梗和分生孢子。分生孢子梗褐色，有分隔；分生孢子棍棒狀，有多個隔膜，褐色，見圖4。

圖3 粉葛棒孢霉葉斑病為害癥狀

圖4 棒孢霉真菌分生孢子形態

2.3 粉葛白絹病(Selerotium rolfsii)

白絹病主要危害粉葛塊莖或莖基部，起初莖基部的表皮會變成褐色，隨后莖基部表皮上會出現一些病斑，多數情況下病斑無規則。隨著病情的發展，發病部位逐漸腐爛，表面或近地面土表覆有白色絹絲狀菌絲體。后期在菌絲體內形成很多油菜籽狀的小菌核，初為白色，后漸變為淡黃色至黃褐色，見圖5。白絹病是一種典型的土傳病害，寄主范圍廣，能夠侵染許多作物，導致嚴重危害。

圖5 粉葛白絹病在葛根上癥狀

2.4 粉葛枯萎病

粉葛枯萎病是一種土傳病害，主要危害粉葛塊根及莖蔓基部，近年在葛藤上也發現該病的危害。該病可在粉葛的全生育期發生，其中以6—8月發病最多，特別是臺風過后會有發病高峰期。粉葛感病前期，葛根的尖端或中部表皮會出現褐色的水漬狀病斑，靠近土表的莖蔓基部最容易發病，病部不規則形，病部變黑，莖開裂，濕度大時，可見病部產生大量的粉紅色霉體(分生孢子)，感病后期莖基部皮下組織變褐色，出現干腐現象，植株逐漸萎蔫，枯死，見圖6。

圖6 粉葛枯萎病發病癥狀

2.5 粉葛炭疽病菌的分離和鑒定

2.5.1 癥狀觀察

炭疽病菌可侵染粉葛的葉片、藤蔓和莖。葉片上呈現近圓形或不規則灰褐色斑點，邊緣處呈現暗褐色，病斑外圈伴隨有少許黃暈，嚴重的葉片出現大面積變色。粉葛藤蔓出現多處壞死，病部有褐色病斑，病斑沿著莖稈縱向發展，為長橢圓形，見圖7。嚴重時莖部開裂，出現枯萎和腐爛癥狀。濕度較大時，病部可見紅色粘質(分生孢子)。

圖7 粉葛炭疽病在葉片和莖上田間癥狀

2.5.2 病原菌的分離

選取病健交界處的病害組織進行平板培養，培養4d后挑選分離較好的從組織塊長出來的真菌，并轉移至新的PDA培養基上進行純化培養。再次培養4d后，得到疑似病原真菌12個，將這12個疑似病原菌進行驗證。

2.5.3 病原菌的致病性測定

將上述分離出的12個疑似致病菌，進行致病性測定，結果表明，有5個分離物出現了與田間炭疽病相同癥狀，見圖8。進一步分離，得到相同真菌菌落。

圖8 炭疽病菌接種粉葛莖和葉片發病癥狀

2.5.4 病原菌的形態特征

粉葛炭疽病菌在PDA培養基上形成近圓形菌落，菌絲顏色為白色，菌絲較長且茂盛，質地長絨毛狀或絮狀，隨著培養時間的延長，菌落變為黑褐色，見圖9。

圖9 粉葛炭疽病菌在PDA平板上的菌落形態

在顯微鏡下觀察，其分生孢子著生在分生孢子盤上，分生孢子梗無色，分生孢子單胞無色，橢圓形或長圓柱形，內含2個油球，見圖10。根據分生孢子的形態初步判斷，致病菌屬于炭疽菌屬(Colletotrichum)。

2.5.5 病原菌的分子生物學鑒定

利用ITS通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTG AACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)對FGCG08菌株進行PCR擴增，將擴增后的純化PCR產物進行測序。得到577bp長度的產物。

圖10 炭疽病菌FGCG08在顯微鏡下觀察的分生孢子形態

將測序結果進行同源性對比，發現致病菌的序列在Genbank中與膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)的同源性達到98%，構建系統發育樹，見圖11。結合病原菌的形態學特征，將病原菌鑒定為膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)。

圖11 粉葛炭疽病菌FGCG08菌株ITS序列的系統發育樹

3 結束語

本文通過對合水粉葛常見病害調查及病原菌分離鑒定，鑒定出5種真菌病害，粉葛棒孢葉斑病、粉葛炭疽病、粉葛銹病、粉葛白絹病、粉葛枯萎病；簡要描述了5種病害的為害特征，并就粉葛炭疽病作了詳細的病原菌分離和鑒定，得出粉葛炭疽病是由膠孢炭疽菌引起的，為生產上粉葛病害的有效防治提供了科學依據。