超高效液相色譜串聯質譜測定大閘蟹中五種核苷酸

陳旭晉 陸宇陽 曹佳 周鋒杰 沈林林

(蘇州市農產品質量安全監測中心，江蘇 蘇州 215000)

大閘蟹學名中華絨螯蟹，是河蟹的一種。其營養豐富，味道鮮美，深受人們的喜愛。大閘蟹之所以口味鮮美，是因為其含氮化合物(游離氨基酸、核苷酸)和非含氮化合物(有機酸、糖類)，其中，核苷酸對其滋味有著重要作用[1]。部分核苷酸如5′-腺嘌呤核苷酸(AMP)、5′-肌苷酸(IMP)、鳥苷酸(GMP)等有明顯的鮮味特點。三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)作為能量物質在機體死亡之后，會降解成呈味核苷酸，提高鮮味[2]。

目前核苷酸的檢測方法主要有近紅外快速檢測[3]、紫外分光光度計[4]、高效液相色譜法等[5,6]。近紅外快速檢測與傳統檢測方法不同，其檢測結果的準確性幾乎完全依賴于一個成熟的數據庫。紫外分光光度計適合純度較高，干擾較少的樣品，不適用于基質復雜的組分。目前最常用的方法是高效液相色譜法。液相色譜法分析速度快，操作也簡單，但是在分析部分結構相似，性質相近的物質時，色譜峰較難分離。液質聯用法相比液相色譜法，即使化合物沒有在色譜柱上完全分開，但通過特征離子質量色譜圖也可以進行準確的定性和定量。因此，本文擬采用超高效液相色譜串聯質譜法對大閘蟹中5種核苷酸進行分離測定，并驗證方法的準確性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑

乙腈(HPLC，Honeywell)，亞甲基二磷酸(AR，TCI)；高氯酸，氫氧化鈉(GR，國藥集團)；實驗用水為Milli-Q超純水(美國Millipore)。

1.1.2 標準物質

ATP、ADP、AMP、IMP、GMP(LGC，純度≥99%)。

1.2 儀器與設備

QTRAP 5500串聯四極桿質譜系統(美國AB SCIEX)；H_Class超高效液相色譜串聯質譜儀(美國Waters)。

1.3 樣品制備

將鮮活大閘蟹樣品分解為若干大塊，放入粉碎機制成勻漿。取勻漿放入冷凍干燥機中凍干，將凍干后的樣品研磨成粉狀，過10目篩得到待測樣品。

1.4 標準溶液配制

準確稱取ATP、ADP、AMP、IMP、GMP標準品各約10mg，于100mL容量瓶中，用水稀釋并定容至刻度，得濃度為100μg·mL-1的標準中間液。使用時稀釋為5ng·mL-1、10ng·mL-1、50ng·mL-1、100ng·mL-1、200ng·mL-1、500ng·mL-1的標準曲線溶液。

1.5 前處理方法

稱取供試試料0.1g于50mL離心管中，加入0.6mol·L-1高氯酸溶液3.0mL提取，渦旋混勻1min，振蕩5min，4℃，10000rpm·min-1離心10min。重復上述步驟。合并2次上清液，將pH調整為6.7～7.0，取去離子水定容至50mL。過0.22μm濾膜后上機。

1.6 儀器條件

1.6.1 液相條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1mm×100mm，1.8μm)。柱溫：40℃。流動相A為乙腈，流動相B為10mM乙酸銨(含5μM亞甲基二磷酸)。梯度洗脫：0min，1%A，99%B；3.5min，1%A，99%B；4min，10%A，90%B；8min，10%A，90%B；8.5min，1%A，99%B；10min，1%A，99%B。流速：0.2mL·min-1。

1.6.2 質譜條件

離子源：ESI；實驗方式：MRM；掃描方式：ATP、ADP為負離子掃描，AMP、IMP、GMP為正離子掃描；離子化電壓：5500V，-4500V；溫度：550℃；輔助加熱氣：55psi；氣簾氣：55psi。詳細參數見表1。

2 結果與分析

2.1 色譜柱及流動相的選擇

文獻中高效液相色譜法測定呈味核苷酸都用C18柱[7,8]。但部分核苷酸極性較大，在普通的C18柱上不易保留。需要使用高濃度、高比例的磷酸鹽溶液，才能有效分離及保留目標物，對色譜柱有較大損傷。因此，本實驗考察了Waters ACQUITY UPLC BEHAmide和Waters ACQUITY UPLC HSS T3。Amide柱是正向色譜柱。在正離子掃描模式下AMP、GMP色譜峰均有一定程度拖尾，IMP分離效果不佳。負離子掃描的ATP及ADP峰形很差。T3柱采用雙鍵鍵合C18技術，采用三官能團C18烷基鍵合相，鍵合密度高，對極性化合物具有更好保留，并且能做到和100%水相兼容。5種核苷酸在T3柱上可以很好的保留及分離。

表1 5種核苷酸MRM離子對信息

在乙腈-0.1%甲酸水的體系下，AMP、GMP、IMP峰形及相應良好，負離子模式下的ADP及ATP沒有響應。在乙腈-10mmoL·L-1乙酸銨體系下，5種核苷酸均得到較好的保留和分離，峰形稍差。考慮到液相色譜法中會用到磷酸鹽緩沖液，嘗試在流動相中加入了微量的亞甲基二磷酸，發現對峰形有較明顯的改善作用。詳見圖1。

2.2 線性關系及最低檢出濃度

將1.4配制的系列標準曲線溶液分別進樣2μL，以5種核苷酸峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線。由表2可知，線性范圍為5～500ng·mL-1時，標準曲線相關系數在0.99901～0.99999，線性良好。在信噪比(S/N)為3時，最低檢出濃度在0.23～0.98ng·mL-1。

2.3 精密度測試

同一樣品經過1.5處理后，在1.6的條件下重復進樣6次，AMP、GMP、IMP、ADP、ATP的平均含量分別是14.2mg·100g-1、1.90mg·100g-1、6.23mg·100g-1、22.2mg·100g-1、7.14mg·100g-1，相對標準偏差分別是1.96%、1.21%、4.09%、2.45%、1.92%。

圖1 T3柱不同流動相體系色譜峰比較

表2 5種核苷酸線性關系及最低檢出濃度

2.4 加標回收測試

回收率測試是衡量標準準確性的重要指標。稱取等量大閘蟹凍干樣品18份，按3水平3平行的方式加入標準溶液，按1.5進行處理，在1.6的條件下上機檢測，計算回收率，結果見表3。結果顯示,5種核苷酸在3水平加標下平均添加回收率在91.7%～100%，相對標準偏差在1.03%～6.98%。方法準確度符合要求。

表3 5種核苷酸回收率測定結果

3 討論

本文建立了超高效液相色譜串聯質譜測定大閘蟹中5種核苷酸，方法操作簡單，線性關系、精密度、準確度均能符合要求，可用于測定大閘蟹5種核苷酸的檢測。與傳統的液相色譜法相比，擁有更高的靈敏度及更短的檢測時間。解決了GMP、ATP、IMP這3種組分分離效果差，無法準確定量的問題。減少了有機相溶液的消耗，對環境友好。也不需要使用高濃度的磷酸鹽緩沖液，減少對色譜柱的損傷。

4 結論

采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱，以乙腈-10mM乙酸銨(含5μM亞甲基二磷酸)為流動相梯度洗脫，在電噴霧離子源下正、負切換掃描，多反應監測模式下，對5種核苷酸進行準確的定性及定量。5種核苷酸在5～500ng·mL-1濃度范圍內線性關系良好，且方法準確度、精密度較高。