類風濕關節炎患者合并巨細胞病毒、EB病毒感染的實驗室檢測指標研究

彭 武，巫麗娟，魏 彬，陳 捷

四川大學華西醫院實驗醫學科，四川成都 610041

類風濕關節炎(RA)是以慢性、對稱性和侵蝕性關節炎為主要臨床表現的系統性自身免疫疾病。我國RA患病率為 0.32%～0.36%，可以在任何年齡發病，女性發病率是男性的2～3 倍[1]。如果不及時治療，會導致軟骨退化和侵蝕、全身并發癥、身體衰弱甚至死亡[2]。盡管RA發病機制至今尚無定論，但目前主要認為遺傳、內分泌、環境、細胞凋亡及感染等因素可通過某些途徑影響RA的發生和發展，其中病毒感染被認為是最重要的致病因素[3-5]。研究表明，巨細胞病毒(CMV)和EB病毒等多種病毒感染可能在 RA 發生發展中起著重要的作用[6]，特別是EB病毒被認為是RA最常見的致病因素[7]。另一方面，RA患者的治療通常需要服用生物制劑(如英夫利昔單抗)、糖皮質激素及慢作用抗風濕藥[如甲氨蝶呤(MTX)]等中的一種或多種藥物，這些藥物在抗類風濕關節炎的同時也降低了機體的免疫功能，易引起CMV、EB病毒等繼發感染[8]。此外，CMV和EB病毒還會對RA患者治療和預后產生影響。在治療方面，DAVIS等[9]研究發現，CMV持續介導的 T 細胞免疫變化可能會影響早期RA患者對抗風濕藥物治療的臨床反應。有研究報道RA患者基線外周血EB病毒DNA載量與利妥昔單抗治療效果有關，以及EB病毒感染在MTX治療RA合并相關大B細胞淋巴增生性疾病患者腫瘤發生和消退中起作用[10-11]。DAVIS等[12]研究結果表明，CMV感染的免疫反應可能在RA患者炎癥和放射學關節損傷的進展中發揮重要作用。PIERER等[13]研究發現，潛伏的CMV感染會加重RA的臨床病程。BROADLEY等[14]觀察到CMV感染的RA患者死于心血管疾病的風險增高。SATOU等[15]研究發現，MTX治療 RA 患者會使包括EB病毒陽性皮膚黏膜潰瘍等MTX相關淋巴組織增生性疾病的數量增加。研究者還報道了EB病毒感染的RA患者發生中樞神經系統淋巴瘤、口腔扁平苔蘚和EB病毒性肝炎等多種并發癥的案例[16-18]。而且，CMV本身就可導致被感染患者從輕微無癥狀感染到嚴重缺陷或死亡的各種結局；EB病毒則是傳染性單核細胞增多癥的病原體，與鼻咽癌、兒童淋巴瘤的發生密切相關，EB病毒是可能致癌的人類腫瘤病毒之一。CMV和EB病毒不僅在 RA發生發展中起作用，還會影響 RA 患者的治療和預后，所以，對RA患者合并CMV和EB病毒感染的監測及易感因素的研究具有重要價值。本研究旨在研究RA患者合并CMV和EB病毒感染的臨床實驗室相關檢測指標，為臨床預測RA患者合并CMV、EB病毒感染及改善這類患者的治療和預后提供參考依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2020年12月在四川大學華西醫院就診的RA患者126例作為研究對象。納入標準：(1)符合最新的 RA 相關指南或專家共識中的確診標準[19]；(2)同時檢測了CMV-DNA和EB病毒DNA；(3)相關實驗室檢查資料完整。排除標準：(1)存在其他病毒感染；(2)同時感染細菌或真菌；(3)存在嚴重基礎疾病；(4)合并其他風濕免疫性疾病、艾滋病、器官移植等免疫缺陷或紊亂。本研究經華西醫院倫理委員會批準，所有研究對象對本研究內容知情并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 CMV-DNA檢測使用湖南圣湘生物科技股份有限公司的人巨細胞病毒核酸定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)，EB病毒DNA檢測使用EB病毒核酸定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)，均在上海宏石全自動醫用PCR分析系統、SLAN?-96P 熒光定量PCR儀上檢測。

1.3方法

1.3.1臨床相關資料收集 通過醫院信息系統收集研究對象基本資料如性別、年齡、治療等情況，以及 RA 相關實驗室指標，如紅細胞沉降率、紅細胞計數、血紅蛋白、血小板計數、白細胞計數、CD3/CD4/CD8T淋巴細胞亞群和絕對計數、CD4/CD8比值、類風濕因子、C-反應蛋白、降鈣素原(PCT)、抗鏈球菌溶血素“O”抗體(抗鏈“O”抗體)、抗環瓜氨酸(CCP)抗體(抗CCP抗體)、免疫球蛋白、補體及抗核抗體。

1.3.2CMV和EB病毒的實驗室檢測 (1)檢測方法。研究對象抽取外周靜脈血至少 2 mL 于含枸櫞酸鈉抗凝劑的采血管中，立即輕輕顛倒混勻，使用圣湘全血基因組提取試劑處理，得到的 DNA 作為待測樣本。取出試劑盒中的各組分，待其溫度平衡至室溫，混勻后備用。根據待測樣本、陰性對照、陽性對照及定量參考品A ～ D的數量，按每人反應液38 μL+酶混合液 2 μL+內標 1.0 μL比例制成 PCR -混合液，瞬時離心后備用。陰性對照、陽性對照、定量參考品A～D分別取10 μL與10 μL核酸釋放劑混勻待用。每個PCR反應管中加入上述處理后的待測樣本、陰性對照、陽性對照及定量參考品A～D各10 μL，在每管中加入PCR-混合液 40 μL，蓋上管蓋(去除氣泡后)，2 000 r/min 離心 30 s。參照PCR儀使用說明書進行參數設置后進行PCR 擴增。(2)結果判讀。質量控制：①陰性對照，無循環閾值(Ct)顯示，但內標檢測為陽性(Ct≤40)；陽性對照，檢測濃度值為(1.35×10-5～1.07×10-6)copy/mL；②4個定量參考品，均檢測為陽性且標準曲線相關系數R2≥0.98。以上要求需在同1次實驗中同時滿足，否則實驗無效，需重新進行。參考區間：目標基因的Ct陽性判斷值為39，內標的Ct陽性判斷值為40(若內標Ct>40或無顯示，則該樣本的檢測結果無效，應查找并排除原因，并對此樣本進行重復實驗)。

2 結 果

2.1基本信息 本研究共納入RA患者共126例，其中女性95例(75.40%)，男性31例(24.60%)；CMV-DNA陽性的RA患者16例，陽性率12.70%；EB病毒DNA陽性的RA患者12例，陽性率9.52%。CMV-DNA和EB病毒DNA同時陽性的RA患者6例，CMV-DNA和EB病毒DNA均陰性的RA患者104例。

2.2CMV-DNA或EB病毒DNA陽性/陰性RA患者的臨床相關指標水平比較 CMV-DNA陽性RA患者的PCT水平[0.12(0.04,0.27)ng/mL]比CMV-DNA陰性RA患者的PCT水平[0.05(0.03,0.08)ng/mL]更高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。EB病毒DNA陽性RA患者各臨床相關指標與EB病毒DNA陰性RA患者之間比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表1 CMV-DNA陽性RA患者與CMV-DNA陰性RA患者臨床相關指標比較

表2 EB病毒DNA陽性RA患者與EB病毒DNA 陰性 RA 患者臨床相關指標比較

續表2 EB病毒DNA陽性RA患者與EB病毒DNA 陰性 RA 患者臨床相關指標比較

2.3EB病毒DNA和CMV-DNA同時陽性/陰性的RA患者臨床相關指標比較 EB病毒DNA和CMV-DNA同時陽性的RA患者IgA水平[4 870.00(3 040.00,5 190.00)]mg/L比二者均陰性的RA患者IgA水平[2 680.00(1 820.00,3 985.00)]mg/L更高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 EB病毒DNA 和CMV-DNA 同時陽性/陰性的 RA 患者臨床相關指標比較

續表3 EB病毒DNA 和CMV-DNA 同時陽性/陰性的 RA 患者臨床相關指標比較

3 討 論

CMV、EB病毒影響RA患者的治療和預后，所以，對RA患者合并CMV和EB病毒感染易感因素的研究具有重要意義。本研究結果顯示，CMV-DNA陽性RA患者的PCT水平比CMV-DNA陰性RA患者的PCT水平更高，差異有統計學意義(P<0.05)；EB病毒DNA和CMV-DNA同時陽性的RA患者IgA水平比二者均陰性的RA患者IgA水平更高，差異有統計學意義(P<0.05)。

健康者體內PCT水平極低，血液中幾乎檢測不到PCT(PCT<0.1 ng/mL)。當機體發生嚴重細菌、真菌、寄生蟲感染，嚴重休克、膿毒癥、全身性炎癥反應綜合征和多器官功能紊亂綜合征時它在血漿中的水平會升高。細菌內毒素在PCT的誘導過程中起到至關重要的作用，所以，PCT可作為一個急性炎癥指標來鑒別細菌和非細菌性感染。自身免疫反應、過敏和病毒感染時PCT一般不升高。但一些研究發現， PCT 可在特殊疾病合并病毒感染時升高，如方琪等[20]研究發現，哮喘合并病毒感染組血清 PCT 及 CRP 表達水平高于單純哮喘組；張正玲等[21]研究結果表明，支氣管擴張合并EB病毒感染患者中的 PCT、CRP、IL-6水平顯著高于非EB病毒感染的支氣管擴張患者;汪俊劍等[22]報道，結締組織病相關性間質性肺炎患者中EB病毒DNA與PCT呈正相關。雖然目前沒有CMV感染導致PCT 水平升高的直接證據，但有研究提到噬血細胞性淋巴組織細胞增生綜合征(HLH)患者CMV感染率和PCT水平同時明顯高于非HLH的血液腫瘤患者[23]，提示CMV感染可能會影響 PCT 水平。本研究結果顯示，CMV感染的RA患者比非CMV感染的RA患者PCT水平更高。這可能是因為CMV感染會加重RA患者炎性反應程度，或病毒感染可促進細菌性感染的發生或增加細菌性感染的風險。本研究結果表明，PCT可作為RA患者感染CMV的預測指標，PCT水平升高可提示臨床醫生對CMV感染患者及早進行檢測和治療。然而CMV感染引起 RA 患者體內PCT水平升高的具體機制還有待進一步明確。

IgA 是機體免疫細胞被細菌、真菌或病毒等抗原激活后，B細胞分化成熟為漿細胞后所合成的一類免疫球蛋白。分兩種類型即血清型IgA和分泌型IgA(SIgA)。血清型 IgA 為單體，免疫作用比較弱。SIgA是機體局部黏膜抗感染免疫的主要抗體，存在于黏膜組織如消化道、呼吸道及泌尿生殖系統。IgA是抑制微生物在黏膜組織附著、減緩病毒繁殖、防止病原體入侵機體的重要免疫屏障[24]。CMV可引起各系統感染，尤其是泌尿生殖系統，從而刺激機體產生CMV-IgA。EB病毒感染可刺激機體產生多種IgA，如Z反式激活因子(Zta)-IgA、早期抗原(EA)-IgA、病毒衣殼抗原(VCA)-IgA和EB病毒核抗原1(EBNA1)-IgA[25-27]。本研究發現，EB病毒DNA陽性RA患者各臨床相關指標與EB病毒DNA陰性RA患者之間比較，差異無統計學意義(P>0.05)；EB病毒DNA和CMV-DNA同時陽性的RA患者IgA水平比二者均陰性的RA患者IgA水平更高，差異有統計學意義(P<0.05)；而有研究也闡述了CMV合并EB病毒感染的傳染性單核細胞增多癥患者 IgA 水平比 EB 病毒單純感染的傳染性單核細胞增多癥患者更高[28]，提示CMV、EB病毒合并感染可能比EB 病毒單獨感染刺激機體產生IgA的作用更強。然而本研究病例數較少，結果需擴大樣本量進一步驗證和謹慎對待。盡管如此，本研究結果還是能在一定程度上表明 IgA 可作為 RA 患者合并 CMV、EB病毒同時感染的潛在依據。

綜上所述，本研究通過回顧性分析確診RA患者合并CMV和EB病毒感染與否的相關臨床資料，發現PCT水平升高可提示 RA 患者 CMV感染，IgA升高可能作為 RA 患者合并CMV、EB病毒同時感染的依據。PCT 和 IgA 在 RA 患者診斷CMV 或 EB病毒 感染中具有重要價值，可作為臨床上改善 RA 患者治療效果、預后的重要檢測指標。