Galectin-9在多發性骨髓瘤患者Th17/Treg失衡中的意義

潘 鑫,王 娟,徐冬云,張亞輝,徐永茂

中國人民解放軍陸軍第七十一集團軍醫院腫瘤血液科，江蘇徐州 221000

多發性骨髓瘤(MM)是一種近年來發病率逐漸升高的血液系統腫瘤，好發于中老年人[1]。MM以分泌異常的單克隆漿細胞在骨髓內大量增殖為主要特征，其發生發展與機體免疫狀態密切相關，特別是與T淋巴細胞亞群有關。調節性T細胞(Treg)和輔助性T細胞 17(Th17)均為重要的T淋巴細胞亞群，前者可控制自身免疫疾病和抑制腫瘤免疫反應起到抗炎作用，后者主要通過分泌白細胞介素-17(IL-17)而起到促炎作用，兩者在細胞分化及功能作用上相互抑制，共同維持機體局部免疫平衡[2-3]。已有學者發現，MM患者體內存在明顯的Th17/Treg失衡,表現為Th17細胞比例升高和Treg細胞比例降低，且有多種因子參與其中[4]。半乳糖凝集素9(Galectin-9)是一種急性髓系白血病、惡性淋巴瘤等血液系統腫瘤中表達異常的半乳糖凝集素，主要參與細胞聚集黏附、機體免疫調節等過程。相關研究顯示，Galectin-9可與其配體T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(Tim-3)結合，在機體免疫效應階段清除效應Th17細胞、抑制T細胞介導免疫反應作用，推測其可能通過與Tim-3作用而參與了Th17/Treg失衡過程[5]。本次研究通過檢測MM患者外周血Th17、Treg細胞水平及Galectin-9表達情況，探討Galectin-9在MM患者Th17/Treg失衡中的作用及與臨床病理關系，以期為臨床判斷MM病情進展及預后提供一定參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月至2021年6月本院收治的105例初診MM患者(MM組)作為研究對象。納入標準：(1)參考文獻[6]確診為MM的初診患者，采血前未進行過放化療、免疫靶向治療等；(2)不伴其他漿細胞相關疾??；(3)研究對象知情并簽署同意書。排除標準：(1)急慢性感染性疾病；(2)傳染性疾病；(3)自身免疫性疾病、惡性腫瘤等或其他血液疾病。另選同期在本院體檢健康人員61例作為對照組，同樣排除急慢性感染性疾病、自身免疫性疾病、傳染性疾病、惡性腫瘤等或其他血液疾病。MM組男67例、女38例，年齡35～75歲、平均(54.76±8.72)歲；對照組男40例、女21例，年齡40～72歲、平均(55.12±8.34)歲。兩組患者性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經本院醫學倫理委員會審核通過。

1.2方法

1.2.1Galectin-9、Tim-3 mRNA相對表達水平檢測 采集MM組患者入院次日、對照組體檢當日空腹靜脈血6 mL，取4 mL于抗凝管中保存，用于分離單個核細胞(PBMC)：將全血與等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻，加入淋巴細胞分離液，以2 000 r/min進行密度梯度離心，吸取中間白色絮狀細胞層，為PBMC。在提取的PBMC中加入Trizol試劑提取總RNA，并檢測RNA濃度。采用SYBR@ Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(日本寶日醫生物技術有限公司)進行RT-PCR反應，擴增反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，40個循環，60 ℃ 30 s退火。內參選用β-action，以2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平。引物為Galectin-9：上游5′-CTTTCATCACCACCATTCTG-3′，下游5′-ATCTGGAACCTCTGAGCACTG-3′；Tim-3：上游5′-CAGATACTGGCTAAATGGG-3′，下游5′-CTTGGCTGGTTTGATGAC-3′；β-action：上游5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。

1.2.2外周血CD4+T、Th17、Treg水平檢測 采用流式細胞儀(BD公司，FACSCalibur型)檢測，采用全血法配置分析液，FACS Multi SET程序獲得CD4+T水平，采用BD Cell Quest軟件分析測定CD4+T中Th17、Treg水平，并計算Th17/Treg比例，試劑盒來自美國羅氏公司。

1.2.3血清IL-17、IL-10水平檢測 采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)：取2 mL全血以3 500 r/min離心10 min后取上清液凍存用于ELISA檢測，將ELISA試劑盒室溫靜置30 min，按照需要濃度稀釋標準品，在各孔中加入血清100 μL和標準品，36 ℃作用90 min，空白孔加入通用的稀釋液及標準品，洗板后在各反應孔加入生物素化抗體100 μL，空白孔加入抗體稀釋液，作用60 min，洗板后各反應孔加入100 μL酶標抗體，空白孔加入酶結合物稀釋液，作用30 min，洗板后各孔加入100 μL 3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺(TMB)顯色，作用15 min，隨后加入100 μL終止液，在3 min內采用酶標儀讀取各標本吸光度(A值)，并根據標準品濃度及對應A值繪制標準曲線。

2 結 果

2.1兩組外周血Galectin-9、Tim-3 mRNA表達情況 MM組Galectin-9、Tim-3 mRNA相對表達水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。Pearson相關性分析顯示，Galectin-9 mRNA與Tim-3 mRNA表達呈正相關(r=0.376，P=0.005)。

表1 兩組外周血CD4+T細胞上Galectin-9表達情況

2.2兩組外周血T淋巴細胞亞群表達情況 MM組患者外周血Th17、Th17/Treg高于對照組，Treg水平低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。Pearson相關性分析顯示，Galectin-9 mRNA與Th17、Th17/Treg表達呈正相關(r=0.491、0.389，P<0.05)，與CD4+T、Treg表達呈負相關性(r=-0.408、-0.477，P<0.05)。

表2 兩組外周血T淋巴細胞亞群表達情況

2.3兩組血清IL-17、IL-10水平及IL-17/IL-10比值比較 MM組血清IL-17、IL-10水平及IL-17/IL-10比值均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組血清IL-17、IL-10水平及IL-17/IL-10比值比較

2.4MM患者Galectin-9 mRNA表達與臨床病理關系 MM患者Galectin-9 mRNA隨ISS分期、DS分期增加而逐漸增高，見表4。Spearman相關性分析顯示，Galectin-9 mRNA與ISS分期、DS分期呈正相關(r=0.604、0.605，P<0.001)；染色體異常、血清游離輕鏈比值(sFLCR)異常患者Galectin-9 mRNA分別高于染色體正常、sFLCR正?；颊撸琍earson相關性分析顯示，Galectin-9 mRNA與染色體、sFLCR呈正相關(r=0.630、0.662，P<0.001)。

表4 MM患者Galectin-9 mRNA與臨床病理關系

續表4 MM患者Galectin-9 mRNA與臨床病理關系

3 討 論

MM是以漿細胞大量增殖為主要特性的惡性血液系統腫瘤，患者體內存在明顯的T淋巴細胞數量和功能異常。相關研究顯示，與健康人群相比，MM患者體內存在CD4+T細胞水平抑制[7]。還有學者發現無論初診或復發MM患者體內均存在明顯的Th17/Treg比例偏高[8]。Treg細胞是一類在多種惡性腫瘤及免疫性疾病中表達異常的淋巴細胞，主要起到抑制效應T細胞和維持自身免疫耐受作用，目前其在MM中表達存在爭議[9]。Th17細胞因具有促炎作用而被認為在MM的溶骨性病變中起到促進病程作用，而在MM中表達情況也并未達成共識[10]。這可能與MM患者個體微環境、疾病進程等多種因素有關。本次研究結果顯示，MM患者外周血Th17占比明顯偏高，而Treg占比偏低，引發Th17/Treg失衡，且平衡向Th17方向移動，提示Th17在MM發病過程中起作用。IL-17是Th17特異性分泌的細胞因子，能促進初始T淋巴細胞向Th17細胞分化，在眾多自身免疫疾病或惡性腫瘤中高表達。相關研究顯示，Treg細胞能通過分泌IL-10、TGF-β等因子來發揮免疫抑制作用[11]。本次研究中顯示MM患者IL-17、IL-10水平及IL-17/IL-10比值均高于健康人群，進一步證實了MM中存在向Th17偏移。有學者認為Th17、IL-17的表達增加是骨髓瘤細胞與其所處微環境相互作用結果[12]。還有研究認為Th17能通過分泌相關細胞因子與惡性腫瘤細胞結合，在促進腫瘤血管生成、骨質破壞等過程中起到重要作用[13]。本次研究中MM患者IL-10表達也升高，這可能與IL-10能引發免疫抑制，促進腫瘤細胞免疫逃逸有關。而IL-17/IL-10比值偏高提示MM患者體內存在IL-17/IL-10比值失衡引發的免疫紊亂，且以Th17細胞分泌的IL-17為優勢，表現為促進骨髓瘤細胞增殖和免疫抑制作用。Galectin-9是一種串聯重復的半乳糖凝聚素，其基因位于染色體17q11.1上，主要起到趨化嗜酸性粒細胞、免疫調節、促進腫瘤細胞侵襲轉移等作用。相關研究顯示，Galectin-9可與Th1細胞表面標記分子Tim-3結合，影響T細胞對IFN-γ的分泌，降低T細胞對腫瘤生長的抑制作用[14]。本研究顯示，MM組Galectin-9、Tim-3 mRNA相對表達水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，提示Tim-3、Galectin-9均參與了MM發生發展過程。本次研究中血Galectin-9 mRNA與Tim-3 mRNA表達呈正相關，提示兩者在MM中可相互影響。多項研究顯示，Tim-3、Galectin-9共同參與了腫瘤浸潤轉移、血管形成、免疫逃逸等多過程調控，而Tim-3/Galectin-9通路能通過介導T細胞失能從而導致腫瘤的進展[15]。Tim-3目前已經被證實能參與Th17的免疫調控過程，且能耗盡機體CD4+T細胞和有效抑制Treg細胞的抗腫瘤免疫功能[16-17]。本研究中Galectin-9 mRNA表達與Th17、Th17/Treg表達呈正相關，與CD4+T、Treg表達呈負相關，提示Galectin-9同樣參與了Th17/Treg失衡過程，而此過程可能是通過Galectin-9/Tim-3通路調節的。還有學者發現，Tim-3、Galectin-9與惡性腫瘤患者臨床病理參數之間存在相關，兩者高表達均可提示預后較差[18]。本次研究中MM患者Galectin-9表達與ISS分期、DS分期、染色體、sFLCR存在一定相關性。其中染色體異常及分期增加多提示預后不良；sFLCR提示克隆性漿細胞水平變化，此指標變化早于骨髓瘤細胞變化[19-20]，提示Galectin-9表達可在早期提示MM病情進展及預后，而此過程可能與Th17/Treg失衡情況密切相關。綜上所述，MM患者存在明顯的外周血Galectin-9水平偏高及Th17/Treg失衡，Galectin-9可能通過調控Tim-3表達參與了Th17/Treg失衡及MM病情進展過程。