恒溫?cái)U(kuò)增芯片法在下呼吸道感染病原體檢測(cè)中的應(yīng)用

王婷婷,劉懷燕,2,黃家望,敖科萍,王中浩,吳重陽(yáng),謝 軼△

1.四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科,四川成都 610041；2.南充市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科,四川南充 637000

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)作為一種新型的檢測(cè)技術(shù)，具有特異度高、效率高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，因此在微生物鑒定診斷領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，可用于感染早期或臨床癥狀不明顯的疾病檢測(cè)[1]。恒溫?cái)U(kuò)增芯片法是利用LAMP結(jié)合微流控芯片檢測(cè)下呼吸道常見(jiàn)病原體的一種新技術(shù)，該技術(shù)針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶的作用下，60～65 ℃恒溫?cái)U(kuò)增，由于其反應(yīng)過(guò)程省略了變性和退火步驟，極大地縮短了檢驗(yàn)周期，15～60 min即可實(shí)現(xiàn)109～1010倍的核酸擴(kuò)增[2]。LAMP已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究、食物基質(zhì)中病原體快速篩選、環(huán)境病原體檢測(cè)及致病性病原體的即時(shí)檢測(cè)[3]。下呼吸道感染是臨床常見(jiàn)的感染性疾病，可由多種病原體引起，包括常見(jiàn)細(xì)菌、真菌、衣原體、支原體及病毒等。細(xì)菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法是臨床診斷下呼吸道感染的常用檢測(cè)手段，但存在陽(yáng)性率低、檢測(cè)周期長(zhǎng)、容易漏檢等問(wèn)題，并且無(wú)法覆蓋不能常規(guī)培養(yǎng)的病原體，導(dǎo)致許多臨床治療依然需要經(jīng)驗(yàn)性使用抗菌藥物。準(zhǔn)確的病原體檢測(cè)可為臨床合理、正確使用抗菌藥物提供依據(jù)，減少耐藥的發(fā)生。基于恒溫?cái)U(kuò)增芯片技術(shù)的試劑盒可檢測(cè)下呼吸道13種常見(jiàn)病原體，檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單，具有較高特異度和靈敏度，已廣泛應(yīng)用于臨床對(duì)于下呼吸道感染的診斷[4]。本研究旨在評(píng)價(jià)恒溫?cái)U(kuò)增芯片法在下呼吸道感染病原體檢測(cè)中的臨床應(yīng)用價(jià)值，并與其采用細(xì)菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取四川大學(xué)華西醫(yī)院2021年1—6月下呼吸道疑似感染患者1 432例作為研究對(duì)象，采集研究對(duì)象合格下呼吸道樣本，包括合格痰液756例、肺泡灌洗液566例及經(jīng)氣管插管收集的深部氣管分泌液110例。研究對(duì)象中男性934例(65.2%)，女性498例(34.8%)，年齡1～96歲，中位年齡為62歲。

1.2儀器與試劑 恒溫?cái)U(kuò)增芯片法檢測(cè)采用北京博奧生物集團(tuán)有限公司的呼吸道病原菌核酸檢測(cè)試劑盒。細(xì)菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法應(yīng)用的血瓊脂平板、巧克力平板及麥康凱平板為鄭州安圖生物工程有限公司產(chǎn)品。細(xì)菌鑒定采用生物梅里埃VITEK2 COMPACT全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)及布魯克科技有限公司基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜儀。質(zhì)量控制菌株采用銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923及糞腸球菌ATCC29212。

1.3方法 恒溫?cái)U(kuò)增芯片法樣本液化、核酸提取、加樣及檢測(cè)步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，采用Rtisochip-W 恒溫?cái)U(kuò)增核酸分析儀檢測(cè)，應(yīng)用其相應(yīng)軟件進(jìn)行結(jié)果判讀。可以檢測(cè)的病原體包括肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、肺炎支原體和肺炎衣原體。細(xì)菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法標(biāo)本接種、分離培養(yǎng)及菌種鑒定按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第4版進(jìn)行，采用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)及質(zhì)譜儀進(jìn)行菌種鑒定。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，兩兩比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。一致性分析采用Kappa檢驗(yàn)，Kappa≥0.75為一致性高，0.40≤Kappa<0.75為一致性一般，Kappa<0.40為一致性差。

2 結(jié) 果

2.1研究對(duì)象總體檢測(cè)情況比較 研究對(duì)象采用恒溫?cái)U(kuò)增芯片法檢測(cè)出陽(yáng)性例數(shù)為597例(陽(yáng)性率為41.7%)，采用細(xì)菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)出陽(yáng)性例數(shù)為530例(陽(yáng)性率為37.0%)，兩種方法檢測(cè)的陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。兩種方法檢測(cè)結(jié)果完全相同的病例共有1 003例，檢測(cè)一致率為70.0%，兩種方法檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，但陽(yáng)性結(jié)果完全不同的病例共有37例(2.6%)。對(duì)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，756例合格痰液樣本采用恒溫?cái)U(kuò)增芯片法檢測(cè)的陽(yáng)性率(43.5%)高于細(xì)菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)的陽(yáng)性率(36.4%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肺泡灌洗液及深部氣管分泌液樣本采用兩種方法檢測(cè)的陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 兩種方法檢測(cè)陽(yáng)性率比較[n(%)]

2.2不同種類病原體檢測(cè)情況比較 兩種方法對(duì)銅綠假單胞菌檢測(cè)一致性高(Kappa≥0.75)，對(duì)流感嗜血桿菌、大腸埃希菌、肺炎鏈球菌及嗜麥芽窄食單胞菌檢測(cè)一致性低(Kappa<0.40)。見(jiàn)表2。恒溫?cái)U(kuò)增芯片法對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血桿菌、大腸埃希菌、肺炎鏈球菌及結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群檢測(cè)陽(yáng)性率比細(xì)菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)陽(yáng)性率高(P<0.05)，細(xì)菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)嗜麥芽窄食單胞菌陽(yáng)性率比恒溫?cái)U(kuò)增芯片法檢測(cè)陽(yáng)性率高(P<0.05)，兩種方法檢測(cè)銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。合格痰液樣本的銅綠假單胞菌檢測(cè)一致性高(Kappa>0.75)，而肺泡灌洗液樣本的銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌的檢測(cè)結(jié)果一致性均較高(Kappa>0.75)。另外，因深部氣管分泌液樣本較少未納入分析。見(jiàn)表3。

表2 兩種方法對(duì)不同種類病原體的檢測(cè)情況比較

表3 合格痰液、肺泡灌洗液樣本病原體檢測(cè)情況比較

2.3混合陽(yáng)性結(jié)果檢出情況比較 恒溫?cái)U(kuò)增芯片法檢測(cè)出多種病原體組合的混合陽(yáng)性率比細(xì)菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)的結(jié)果高，其中檢出肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌和嗜麥芽窄食單胞菌等病原體時(shí)，其檢測(cè)結(jié)果較多是同時(shí)合并其他病原體的多種菌混合陽(yáng)性的結(jié)果(混合陽(yáng)性率>60%)；流感嗜血桿菌更多為單一陽(yáng)性結(jié)果。細(xì)菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法與恒溫?cái)U(kuò)增芯片法檢測(cè)情況不同，肺炎鏈球菌和嗜麥芽窄食單胞菌培養(yǎng)陽(yáng)性通常出現(xiàn)在與其他病原體的混合陽(yáng)性結(jié)果中，其他細(xì)菌則更多檢出為單一陽(yáng)性結(jié)果。恒溫?cái)U(kuò)增芯片法對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌等病原體的混合陽(yáng)性率高于細(xì)菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 兩種方法檢測(cè)不同病原體的混合陽(yáng)性率比較

續(xù)表4 兩種方法檢測(cè)不同病原體的混合陽(yáng)性率比較

2.4恒溫?cái)U(kuò)增芯片法檢測(cè)病原體分布特點(diǎn) 采用恒溫?cái)U(kuò)增芯片法檢出的病原體前5位依次為鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌和金黃色葡萄球菌。對(duì)于培養(yǎng)周期長(zhǎng)的結(jié)核分枝桿菌及無(wú)法進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)的幾類下呼吸道常見(jiàn)病原體：肺炎支原體、肺炎衣原體、嗜肺軍團(tuán)菌，恒溫?cái)U(kuò)增芯片法檢出結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性共24例，肺炎支原體、肺炎衣原體、嗜肺軍團(tuán)菌各1例。

3 討 論

本研究納入1 432例疑似下呼吸道感染患者，采用恒溫?cái)U(kuò)增芯片法檢測(cè)的陽(yáng)性率高于細(xì)菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明恒溫?cái)U(kuò)增芯片法檢測(cè)靈敏度更高，這與其他研究報(bào)道結(jié)果一致[5-7]。細(xì)菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法可能存在假陰性結(jié)果，造成假陰性的原因可能是部分患者在檢測(cè)前接受了抗菌藥物治療，對(duì)病原體培養(yǎng)產(chǎn)生抑制作用。尤其在流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌等檢測(cè)中，由于其培養(yǎng)要求高、培養(yǎng)過(guò)程影響因素多，可導(dǎo)致細(xì)菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法陽(yáng)性率降低。

除了陽(yáng)性率差異，兩種方法在不同菌種中檢測(cè)的一致性表現(xiàn)也有差異。有研究報(bào)道，恒溫?cái)U(kuò)增芯片法和細(xì)菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法對(duì)于銅綠假單胞菌的檢測(cè)陽(yáng)性率一致性高，對(duì)于肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的檢測(cè)陽(yáng)性率一致性較低[8]，與本研究結(jié)果一致。由于本研究納入合格痰液、肺泡灌洗液和深部氣管分泌液樣本，為明確痰液中口腔正常菌群對(duì)病原菌的檢出是否有影響，研究進(jìn)一步做了區(qū)分樣本類型的檢測(cè)一致性比較，由于深部氣管分泌液樣本少未納入分析，結(jié)果表明，肺泡灌洗液樣本銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌檢測(cè)陽(yáng)性率一致性相比合格痰液有了進(jìn)一步提高，這與文獻(xiàn)[9]研究結(jié)果一致。

另外，由于規(guī)避了多種病原體共培養(yǎng)的生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)問(wèn)題，恒溫?cái)U(kuò)增芯片法對(duì)于鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌等多種病原體混合陽(yáng)性率較細(xì)菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法更高(P<0.05)，有利于為其感染的可能致病菌提供更為全面的微生物學(xué)證據(jù)。左麗娜等[10]也報(bào)道了相同的結(jié)果。此外，有研究報(bào)道，恒溫?cái)U(kuò)增芯片法準(zhǔn)確度高、靈敏度高、特異度強(qiáng)、反應(yīng)省時(shí)，可以作為肺炎克雷伯菌的快速檢測(cè)方法[11]。

本研究的病原體包括培養(yǎng)陽(yáng)性率低、周期長(zhǎng)的結(jié)核分枝桿菌，無(wú)法常規(guī)培養(yǎng)的肺炎支原體、肺炎衣原體及嗜肺軍團(tuán)菌，對(duì)于這類病原體，恒溫?cái)U(kuò)增芯片法可顯著提高檢測(cè)靈敏度。國(guó)內(nèi)外已開(kāi)展了應(yīng)用LAMP技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌快速診斷中臨床價(jià)值的研究，結(jié)果顯示，其檢測(cè)特異度、靈敏度均較高，分別為96%和80%[12-13]。本研究恒溫?cái)U(kuò)增芯片法檢出結(jié)核分枝桿菌共24例，采用恒溫?cái)U(kuò)增芯片法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的陽(yáng)性率高于細(xì)菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法陽(yáng)性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。李輝騰等[14]研究顯示，恒溫?cái)U(kuò)增芯片法可快速、準(zhǔn)確檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌。有研究發(fā)現(xiàn)，恒溫?cái)U(kuò)增芯片法對(duì)于檢測(cè)肺炎支原體感染優(yōu)勢(shì)明顯[15]。本研究檢出肺炎支原體、肺炎衣原體及嗜肺軍團(tuán)菌各1例，為臨床感染的診斷治療提供了較明確的微生物學(xué)證據(jù)，此類病原體無(wú)法常規(guī)進(jìn)行培養(yǎng)，需通過(guò)血清學(xué)或宏基因組測(cè)序(mNGS)等方法進(jìn)行檢測(cè)，缺乏金標(biāo)準(zhǔn)，恒溫?cái)U(kuò)增芯片法檢測(cè)快速、靈敏，是一種可靠的病原學(xué)篩查方法。

綜上所述，恒溫?cái)U(kuò)增芯片法與細(xì)菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，具有快速、靈敏、高效的特點(diǎn)，可一次性同時(shí)檢測(cè)13種常見(jiàn)呼吸道病原體，檢測(cè)周期僅需2～4 h，對(duì)多種呼吸道病原體檢測(cè)的陽(yáng)性率高于細(xì)菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法，恒溫?cái)U(kuò)增芯片法有利于快速診斷下呼吸道感染的真正病原菌，尤其是苛養(yǎng)菌、慢生長(zhǎng)菌和不可培養(yǎng)病原體的快速診斷。恒溫?cái)U(kuò)增芯片法也具有自身的局限性，它所包含的13種呼吸道病原體并未完全覆蓋呼吸道感染常見(jiàn)細(xì)菌，比如陰溝腸桿菌、卡他莫拉菌等，此類病原體的檢測(cè)仍需依靠細(xì)菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行補(bǔ)充。因此，針對(duì)疑似下呼吸道感染的患者，建議臨床聯(lián)合應(yīng)用兩種檢測(cè)方法，充分利用不同方法的優(yōu)勢(shì)，為臨床診療的綜合分析提供及時(shí)、可靠的依據(jù)。