MALDI-TOF-MS技術在臨床分離絲狀真菌鑒定中的應用研究*

謝春霞，孫玉娟，馬艷輝，趙自云

青島市中心醫院檢驗科，山東青島 266042

近年來，隨著免疫制劑的不斷應用、介入治療技術的開展及抗菌藥物的更新換代，使得臨床真菌感染患者越來越多，其致死率明顯上升[1]。臨床真菌感染主要以絲狀真菌和酵母型真菌感染危害最大，其中絲狀真菌在某些特定人群中感染率超過酵母型真菌[2]。真菌感染病情嚴重，進展迅速，不同屬種真菌對臨床常用一線抗真菌藥物敏感性不同，效果有限，因此，及時有效的診斷及感染真菌種屬鑒定對于指導臨床抗真菌用藥治療意義重大。目前，對于臨床微生物的實驗室檢測主要依靠傳統形態學和基因分子生物學，然前者準確率低、耗時長，要求檢測人員具有豐富的真菌鑒定經驗及專業知識水平，且對于傳統形態學較相似的菌株無法準確鑒別；后者鑒定結果精確，但其成本高，對實驗室條件及環境要求高，不適合臨床常規開展[3]?；|輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)技術是近年新興的一種微生物鑒定技術，適用于細菌、真菌及病毒的鑒定，準確性高，快速、便捷，近年在細菌、酵母型真菌中的鑒定能力得到肯定[4-5]。因絲狀真菌結構復雜，蛋白提取預處理方法尚未形成標準化操作流程等使得MALDI-TOF-MS技術在臨床絲狀真菌鑒定中的應用相對滯后，相關報道有限。因此本研究結合傳統形態學和分子生物學DNA測序，綜合對比探究了MALDI-TOF-MS技術在臨床分離絲狀真菌中的鑒定效果。

1 材料與方法

1.1實驗菌株 收集2019年1-12月本院臨床標本中分離培養的230株常見絲狀真菌，經初步鑒定為絲狀真菌菌株，低溫保存于菌種保存管。校準菌株為大腸埃希菌ATCC8739，質控菌株為ATCC10106產黃青霉、ATCC16888黑曲霉(購自法國梅里埃生物公司)。

1.2儀器與試劑 MALDI-TOF-MS質譜儀購自法國生物梅里埃公司；ABI600PCR儀購自美國ABI公司；沙氏培養基購自北京智杰方遠科技有限公司；凝膠成像系統購自英國Syngene公司；血平板購自美國賽默飛公司；DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；PCR產物測序及真菌引物合成由上海生工公司完成；BASO棉藍染液購自珠海貝索生物有限公司；甲酸、乙腈購自德國布魯克公司；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、通用引物ITS1和ITS4購自生工Sangon Biotech公司等。

1.3方法

1.3.1真菌分離培養及傳統形態學鑒定 將收集菌株接種于沙氏培養基，置于20 ℃培養箱培養2～14 d；待絲狀真菌長出菌落后，取清潔載玻片滴加棉藍染液1滴，透明膠帶取少許菌絲貼于載玻片，于顯微鏡下觀察鑒定菌落及菌絲、孢子形態，行傳統形態學鑒定絲狀真菌菌屬。

1.3.2DNA分子生物學檢測 根據試劑盒說明書提取真菌DNA，采用通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增，引物序列ITS1正向：5′-TCCGTACTGAAGCTGCGG-3′，ITS4反向：5′-TCCTCGCGTTATTCATATGC-3′；PCR反應體系：正向、反向引物各1 μL，DNA模板2 μL，2×easy Taq Super Mix 13 μL，ddH2O 8 μL，總體積25 μL；反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環30次；結束后取5 μL PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳觀察目的片段，測定核酸序列，將測定結果與Genbank數據庫序列進行比對鑒定絲狀真菌。

1.3.3MALDI-TOF-MS技術鑒定 將收集的絲狀真菌菌株點種于沙氏培養基，30 ℃培養24～48 h，在1.5 mL離心管加入無菌水300 μL，挑取10 mg菌體加入混勻，再加入無水乙醇900 μL，均勻，13 000 r/min離心2 min，棄上清，室溫靜置2 min待菌體完全干燥；加入70%甲酸溶液，吹打混勻沉淀，室溫靜置2 min，加入乙腈，混勻離心2 min，取上清液1 μL點于靶板，晾干，加入基質溶液1 μL覆蓋，晾干，將靶板放入質譜儀進行鑒定。使用MALDI Biotyper3.0系統進行數據庫比對，分析鑒定結果。鑒定標準[6]：鑒定得分>1.7分表示準確鑒定到種水平，1.5～1.7分表示鑒定到屬水平，<1.5分表示無鑒定結果。每株菌點3個靶點，行平行檢測，取得分最高點計入數據統計。

1.4統計學處理 采用SPSS25.0統計軟件進行數據分析，檢出率、符合率等計數資料采用n(%)表示，行χ2檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1菌株來源及種類分布 研究收集到臨床標本分離的絲狀真菌230株，包括曲霉菌屬183株(79.6%)、青霉菌屬23株(10.0%)、鐮刀菌屬13株(5.7%)、根毛霉3株(1.3%)、石膏樣小孢子菌6株(2.6%)、米根霉2株(0.9%)，曲霉菌屬以煙曲霉、黃曲霉和黑曲霉為主。絲狀真菌主要來源于痰液及肺泡灌洗液標本共有205株(89.1%)，其次為角膜分泌物和耳道分泌物；痰液中分離最多的是曲霉菌屬，其次為青霉菌屬；鐮刀菌屬可見于多種標本，具體菌株來源及種類分布見表1。

表1 230例絲狀真菌菌種來源及分布[n(%)]

續表1 230例絲狀真菌菌種來源及分布[n(%)]

2.2傳統形態學鑒定結果 經傳統形態學鑒定菌落形態，綜合鏡檢結果，準確鑒定到種水平的有159株(69.1%)，鑒定到屬水平的有71株(30.9%)；傳統形態學在煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉等常見曲霉菌中可鑒定到種水平，對于少見曲霉及青霉菌屬、鐮刀菌屬、根毛霉、米根霉等僅鑒定到屬水平，見表2。常見絲狀真菌菌落形態及鏡下形態見圖1。

圖1 常見絲狀真菌菌落形態及鏡下形態

2.3DNA測序分析與MALDI-TOF-MS技術鑒定結果 提取培養菌株DNA后行PCR擴增，電泳結果見圖2。230株絲狀真菌經DNA測序分析鑒定到種水平的準確率為100.0%。MALDI-TOF-MS技術鑒定根據不同菌種特有的質譜峰，結果顯示，鑒定到絲狀真菌種水平的有204株(88.7%)，主要為曲霉菌屬和鐮刀菌屬；鑒定到屬水平的有26株(11.3%)，主要為青霉菌屬、根毛霉、米根霉等及其他曲霉屬。MALDI-TOF-MS技術鑒定絲狀真菌曲霉菌屬中煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉及鐮刀菌屬到種水平的準確率高達100.0%，與DNA測序方法結果符合一致；鑒定青霉菌、根毛霉、米根霉、石膏樣小孢子菌僅到屬水平，不同鑒定方法結果見表2。

圖2 絲狀真菌PCR擴增電泳圖

表2 230株絲狀真菌傳統形態學、MALDI-TOF-MS技術、DNA測序鑒定分析比較

續表2 230株絲狀真菌傳統形態學、MALDI-TOF-MS技術、DNA測序鑒定分析比較

2.4傳統形態學、DNA測序與MALDI-TOF-MS技術鑒定結果比較 以DNA測序結果為準，MALDI-TOF-MS技術鑒定到絲狀真菌種水平的準確率為88.7%(204/230)顯著高于傳統形態學鑒定的69.1%(159/230)；鑒定到屬水平的準確率為11.3%(26/230)，顯著低于傳統形態學鑒定的30.9%(71/230)，差異有統計學意義(χ2=26.455，P<0.001)。

3 討 論

近年來，臨床真菌感染病例越來越多，由其引起的病死率也逐漸增高，與抗真菌治療延遲密切相關。絲狀真菌是臨床常見且特殊的真菌種類，其種類多，分類復雜，不同種屬菌株耐藥不同，對一線抗真菌藥物反映效果不同[6]。據相關研究報道，由曲霉、鐮刀菌等絲狀真菌引起的深部感染近年明顯增多，抗真菌藥物治療使得耐藥病原菌數量、種類明顯增加；絲狀真菌感染病原菌分布呈現煙曲霉感染比例下降，非煙曲霉和非曲霉絲狀真菌感染比例增加的特點，甚至在某些特定人群中感染率超過酵母菌[7-8]。所以，快速準確的鑒定臨床真菌種屬水平對針對性指導臨床用藥，降低無效用藥率至關重要。

目前，對于絲狀真菌的鑒定因其復雜的形態特征及絲狀真菌菌株表型特征多變，傳統形態學鑒定使得形態學上很難區別的相似菌株鑒定得到準確結果，限制了深部真菌感染的早期診斷及治療[9]。而基因序列分析技術用于微生物菌株鑒定準確率高，被認為是“金標準”，但其對檢測環境及設備、人員要求較高，操作復雜、成本高，不能作為臨床鑒定的常規方法。MALDI-TOF-MS技術是近年廣泛用于臨床微生物病原菌鑒定的新型軟電離質譜技術，其通過檢測微生物蛋白質指紋圖譜，根據不同菌種特有的質譜峰與質譜圖數據庫中特征性譜圖進行比對，進而快速得出微生物鑒定結果，在細菌同源性分析、病原菌分型、毒力因子鑒定及耐藥檢測等方面表現出優勢[10-12]。目前，MALDI-TOF-MS技術在細菌中的鑒定應用相對成熟，在臨床微生物的快速鑒定中，近年張霄霄等[13]發現MALDI-TOF-MS技術將酵母樣真菌的鑒定率從傳統形態學的79.58%提高至95.07%。HANDAL等[14]報道，與16s rDNA相比，MALDI-TOF-MS技術鑒定197株臨床分離厭氧菌的準確率達94.9%。SLEIMAN等[15]報道，結合德國布魯克基質輔助激光解析電離飛行時間質譜絲狀真菌數據庫和實驗室自建18種曲霉譜圖，將曲霉種水平鑒定率提高了24%。MCMULLEN等[16]采用VITEK質譜基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜鑒定144株曲霉種水平的鑒定率達93.6%，對傳統形態學僅鑒定到屬水平的曲霉菌株均實現了種水平鑒定。另張偉錚等[17]報道，MALDI-TOF-MS技術對曲霉菌屬、毛霉菌屬、毛癬菌屬及毛孢子菌屬等絲狀真菌的鑒定率達96.5%～100.0%，對絲狀真菌鑒定的總體準確率為86.36%，與內部轉錄間隔區測序分析符合率為83.97%。張素婷等[18]對臨床常見真菌鑒定準確性的Meta分析發現，MALDI-TOF-MS技術鑒定真菌合并靈敏度為97%，合并特異度為85%，受試者工作特征曲線下面積為0.908，其對臨床酵母菌屬及絲狀菌屬的鑒定不受菌株來源及儀器等影響，鑒定效果較高。提示MALDI-TOF-MS技術在臨床真菌鑒定中的作用日益顯著，然其應用缺少實踐和經驗積累，尤其絲狀真菌結構復雜，鑒定過程復雜，現階段研究報道鮮少，目前仍處于不斷探索階段。本研究從臨床共分離出230株絲狀真菌，結合傳統形態學鑒定和DNA測序分析顯示，以DNA測序結果為準，MALDI-TOF-MS技術鑒定絲狀真菌到種水平的準確率為88.7%，明顯高于傳統形態學鑒定的69.1%(χ2=26.455，P<0.001)，發現傳統形態學僅對常見曲霉菌屬的鑒定率較高，尤對菌落形態及鏡下形態相近的菌株鑒定較困難；MALDI-TOF-MS技術對曲霉菌屬中煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉和鐮刀菌屬鑒定到種水平的準確率高達100.0%，與DNA測序方法結果符合一致，而對青霉菌、根毛霉、米根霉等僅鑒定到屬水平，低于傳統形態學鑒定的屬水平，與既往相關報道結果近似，提示MALDI-TOF-MS技術能快速準確的鑒定大多數絲狀真菌到種水平，可用于實驗室常規鑒定臨床真菌的有效補充方法以提高真菌種水平的鑒定，為臨床指導用藥治療提供價值參考。

現階段，MALDI-TOF-MS技術在臨床真菌鑒定方面表現出廣闊的應用前景，而其鑒定絲狀真菌較滯后的原因在于，一是質譜技術主要分析的是胞內核糖體蛋白成分，絲狀真菌細胞壁厚且堅韌的特性使得質譜分析不易獲得高質量的質譜圖譜；同時絲狀真菌菌絲和孢子兩種細胞成分的質譜峰圖存在差異[19-20]。近年，國際上相繼開展了大量關于MALDI-TOF-MS技術鑒定絲狀真菌最佳實驗條件的相關研究，指出MALDI-TOF-MS技術鑒定絲狀真菌的最佳培養基為沙氏葡萄糖液體培養基，培養時間為24 h，并指出采用甲酸-乙腈提取法用于質譜分析前處理有助于破壞細胞壁，進一步釋放胞內核糖體蛋白，獲取高質量質譜峰圖[20]。本研究MALDI-TOF-MS技術鑒定絲狀真菌條件優化，結果顯示，MALDI-TOF-MS技術能有效提高絲狀真菌鑒定率，作為傳統形態學鑒定的有力補充可應用于臨床實驗室，是一種快速、高效的鑒定手段。二是數據庫的局限性，現有臨床常見病原真菌質譜鑒定數據庫涵蓋范圍不夠完善，且由于不同地區鑒定效能在同一數據庫存在差異，及少數臨床真菌缺乏特異性峰值導致其不能鑒定得出[21]。另外MALDI-TOF-MS技術對臨床真菌耐藥性檢測尚未取得突破性進展等均是影響該技術在臨床真菌鑒定中廣泛應用的主要原因。因此，進一步優化質譜分析前處理，繼續更新補充數據庫參考菌種數量，提高MALDI-TOF-MS技術鑒定效能，將在臨床真菌的快速鑒定中發揮更重要的作用。

綜上所述，MALDI-TOF-MS技術鑒定臨床絲狀真菌符合率高，快速、準確且操作便捷，可作為臨床真菌實驗室鑒定的有效補充手段，為真菌鑒定提供了新的選擇。