2016-2019年四川地區HIV-1抗病毒治療患者治療效果及耐藥性分析*

張 燕,李一平,周 玚,蘇 玲,葉 黎,李 玲,楊 洪,梁 姝,袁 丹

四川省疾病預防控制中心,四川成都 610041

越來越多的艾滋病感染者經診斷發現自身的感染狀況，并選擇接受抗病毒治療,其治療比例的提高和藥物使用頻率的增加使得人類免疫缺陷病毒(HIV)在選擇壓力下產生突變，對藥物敏感的野生毒株逐漸被耐藥株取代，使得耐藥株成為優勢株，造成艾滋病感染者抗病毒治療效果下降或失敗，因此其耐藥問題已然成為保證抗病毒治療效果和提高艾滋病感染者生存質量方面的一個重要挑戰[1-4]。通過HIV耐藥監測，可及時發現抗病毒治療患者是否出現耐藥，了解全省的耐藥情況，指導臨床及時調整治療方案，對治療失敗和產生耐藥的原因及時作出科學分析，盡快遏制耐藥株的傳播和流行。本研究對2016-2019年四川地區接受HIV-1 抗病毒治療半年以上艾滋病感染者進行耐藥監測，以評估艾滋病感染者抗病毒治療效果及其在四川地區的耐藥情況，并為后續抗病毒治療方案的制訂和藥物選擇提供科學依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016-2019年四川地區接受HIV-1抗病毒治療半年以上且HIV-1載量檢測>1 000 cps/mL艾滋病感染者作為研究對象,2016-2019年每年納入耐藥監測的研究對象依次為22 552、41 628、57 745和101 599例，研究對象在接受艾滋病抗病毒治療前，均進行了知情同意告知。本次調查經四川省疾病預防控制中心倫理委員會審查批準，編號為SCCDCIRB第2021-025號。

1.2儀器與試劑 全自動核酸提取儀MagNA Pure LC 2.0(羅氏公司),QIAxcel毛細管電泳儀(凱杰公司)，Eppendorf 5333-47507型PCR儀，MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit-High Performance 試劑盒(羅氏公司)，accessquick RT-PCR System(A1702)試劑盒(美國Promega公司)，2×Taq PCR MasterMix試劑盒(天根生化公司)。

1.3方法

1.3.1HIV-1 RNA提取 使用羅氏高純度核酸提取試劑盒，根據標準操作程序提取HIV-1 RNA。

1.3.2PCR擴增HIV-1pol基因區 使用accessquick RT-PCR System(A1702)試劑盒，進行反轉錄和第1輪擴增，反應體系為25 μL,引物為MAW26和RT21；使用2×Taq PCR MasterMix試劑盒，以第1輪擴增反應產物為模板進行第2輪擴增，反應體系為50 μL,引物為PRO-1和RT20[5]。擴增產物長度為1 200 kb，包含了蛋白酶和逆轉錄酶區。反應條件參考《HIV耐藥監測策略和檢測技術》[6]。

1.3.3測序 將PCR產物經毛細管電泳后，1 200 bp處出現條帶的擴增產物送北京諾賽公司進行進一步的純化和一代測序。

1.3.4序列分析 將測得的序列結果用軟件Sequencher 5.0編輯和拼接，然后將拼接結果用軟件Bioedit進行校正，同時與HIV-1 M 組各亞型及0組、N組參考毒株[7]pol基因序列進行比對，比對好的序列用ALiview軟件構建基因進化樹，并確定基因亞型，登錄美國斯坦福大學耐藥數據庫(http://hivdb.stanford.edu)，在線分析發生耐藥突變的位點和突變類型。

1.3.5數據分析 利用WPS 2020建立數據庫，計算病毒學失敗率和耐藥率，病毒學失敗率=HIV-1載量大于1 000 cps/mL的人數/接受HIV-1載量檢測的人數×100%；耐藥率=耐藥人數/HIV-1載量大于1 000 cps/mL的人數。

1.4統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，率的比較采用χ2檢驗，理論頻數<5時，采用Fisher精確檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1病毒學失敗率分析 2016-2019年四川地區艾滋病感染者病毒學失敗率依次為24.91%(5 617例)、14.02%(5 838例)、11.72%(6 769例)和11.54%(11 725例)，呈連續下降趨勢(P<0.05)，其中自貢、瀘州、德陽、綿陽、內江、樂山、南充、宜賓、廣安、雅安、巴中、涼山地區病毒學失敗率呈下降趨勢(P<0.05)，但部分市州如資陽、甘孜病毒學失敗率呈上升趨勢(P<0.05)。見表1。

表1 2016-2019年四川地區艾滋病感染者病毒學失敗率比較

2.2耐藥率分析 對2016-2019年艾滋病感染者中病毒學失敗的樣本進行耐藥檢測，成功獲得序列分別為4 602、4 514、5 731和9 313例，2016-2019年艾滋病感染者病毒學失敗的樣本中每年依次有1 612例(28.7%)、1 634例(27.99%)、2 451例(36.21%)和3 896例(33.23%)出現不同程度耐藥，其中每年依次有1 531例(94.98%)、1 542例(94.37%)、2 086例(85.11%)和3 707例(95.15%)對非核苷類逆轉錄酶抑制劑(NNRTIs)耐藥，814例(50.5%)、900例(55.08%)、1 657例(67.61%)和1 786例(45.84%)對核苷類逆轉錄酶抑制劑(NRTIs)耐藥，92例(5.71%)、95例(5.81%)、117例(4.77%)和196例(5.03%)對蛋白酶抑制劑(PIs)耐藥。2016-2019年自貢、內江、涼山及四川地區的耐藥率呈上升趨勢(P<0.05)。見表2。

表2 2016-2019年四川地區艾滋病感染者耐藥率比較(%)

續表2 2016-2019年四川地區艾滋病感染者耐藥率比較(%)

2.3各個亞型中突變位點分析 2016-2019年四川地區病毒學失敗的艾滋病感染者中發生耐藥的樣本主要亞型有CRF07_BC、CRF01_AE、CRF08_BC和CRF85_BC亞型。2016-2019年CRF07_BC亞型每年依次為917例(56.89%)、888例(54.35%)、1 269例(51.77%)和2 260例(58.01%)；2016-2019年CRF01_AE亞型每年依次為453例(28.1%)、494例(30.23%)、694例(28.31%)和862例(22.13%)；2016-2019年CRF08_BC亞型每年依次為108例(6.7%)、128例(7.83%)、251例(10.24%)和328例(8.42%)；2016-2019年CRF85_BC亞型每年依次為34例(2.11%)、43例(2.63%)、107例(4.37%)和228例(5.85%)。從表3可以看出各亞型對NRTIs發生耐藥性突變的主要位點均為M184V/I和K65R/E，對NNRTIs發生耐藥性突變的主要位點為K103N/S，該位點耐藥突變率呈現逐年升高趨勢。對PIs發生耐藥性突變的主要位點為Q58E，其中D67N、K65R/E、K70R/E、G190A位點在CRF01_AE亞型中發生耐藥突變頻率高于其他亞型，V179D/E位點在CRF85_BC亞型中耐藥突變率較高。2017年Q58E位點在CRF85_BC亞型中耐藥突變率高于其他亞型(P<0.05)，其余3年均在CRF07_BC亞型中突變率較高。2016年M184V/I位點在CRF85_BC亞型中耐藥突變率高于其他亞型，之后連續3年均在CRF07_BC亞型中突變率較高。2016年和2018年K103N/S位點在CRF01_AE亞型中耐藥突變率高，2017年和2019年在CRF85_BC亞型中耐藥突變率較高。2016、2018、2019年V106M/V在CRF85_BC亞型中耐藥突變率較高。2016-2018年連續3年Y181C位點在CRF85_BC亞型中耐藥突變率較高，2019年在CRF01_AE亞型中發生耐藥突變頻率較高。

表3 2016-2019年四川地區艾滋病感染者不同亞型毒株的耐藥突變情況[n(%)]

續表3 2016-2019年四川地區艾滋病感染者不同亞型毒株的耐藥突變情況[n(%)]

3 討 論

2016-2019年四川地區抗病毒治療覆蓋率也在不斷提高，如何在治療過程中防止耐藥發生和耐藥株的傳播及流行顯得尤為重要。本研究結果顯示，四川地區病毒學失敗率呈連續下降趨勢，說明其抗病毒治療工作總體保持較好水平。但其中瀘州、德陽、宜賓、內江、廣安、雅安和涼山州病毒學失敗率仍高于10%，提示應及時進行耐藥監測，分析治療失敗的原因。涼山的病毒學失敗率仍然高于大部分市州，但較往年明顯下降，反映了涼山州在開展艾滋病防治攻堅工作以來抗病毒治療工作已取得一定成效，治療質量明顯提高。資陽、甘孜病毒學失敗率連續4年呈上升趨勢，考慮受擴大檢測和擴大治療的影響，后續應加強宣教，提高質量，進一步規范抗病毒治療管理工作。2016-2019年成都市病毒學失敗率和耐藥率均保持較低水平，這也說明成都市抗病毒治療工作質量較高。成都相較于四川其他市州經濟水平高，醫務人員流動性低、專業素養好等，這些因素均有利于提高抗病毒治療工作質量。2016-2019年自貢、內江、涼山地區艾滋病感染者抗病毒的耐藥率呈現上升趨勢，可能是由于近幾年隨著擴大抗病毒治療覆蓋面，四川地區HIV-1載量檢測力度和檢測及時性不斷提高，耐藥監測范圍逐年擴大，耐藥率也隨之升高。應分析具體耐藥情況，盡快更換二線治療藥物，加強督促服藥，降低耐藥率，在擴大艾滋病感染者抗病毒治療覆蓋面的同時需加強用藥督導，保證治療質量，定期對艾滋病感染者進行CD4+T細胞檢測和HIV-1載量檢測，對HIV-1載量大于1 000 cps/mL但未發生耐藥的艾滋病感染者加以重視，指導和督促其正確用藥，防止潛在耐藥株的形成。

根據四川地區2016-2019年病毒學失敗的艾滋病感染者中發生耐藥的情況來看，主要亞型有CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC和CRF85_BC亞型，其中CRF01_AE和CRF07_BC亞型的耐藥率相對較高，CRF85_BC亞型在耐藥中的占比雖然較低，但連續4年呈上升趨勢。本研究結果顯示，對NRTIs發生耐藥性突變的位點在CRF01_AE中發生耐藥突變頻率高于其他亞型，對NNRTIs和PIs發生耐藥性突變的位點在CRF85_BC中耐藥突變率較高。耐藥突變多以NNRTIs和NRTIs為主，尤其是NNRTIs，突變率達到95%以上，與文獻[8-9]研究結果一致，說明近幾年四川地區耐藥株的亞型構成和藥物突變類型沒有發生明顯變化，各亞型對NRTIs發生耐藥性突變的主要位點均為M184V/I和K65R/E，與鐘活麟等[10]研究結果相似。對NNRTIs發生耐藥性突變的主要位點為K103N/S，與文獻[11-13]研究結果一致，該位點在CRF01_AE和CRF85_BC亞型中突變頻率較高且呈逐年上升趨勢，目前已有科學研究表明，K103N/S位點是接受NNRTI類藥物治療患者中最常見同時也是非常重要的突變，它會對所有NNRTI類藥物引起20～30倍的耐藥性[14]，應加強監測。多個位點如D67N、K65R/E、K70R/E、G190A在CRF01_AE亞型中發生耐藥突變的頻率高于其他亞型，M184V/I、Q58E位點在CRF07_BC亞型中突變頻率較高，與DONG等[15]研究結果一致，今后應加強對感染CRF01_AE亞型毒株患者的耐藥監測和用藥督導，減緩耐藥發生。V179D/E、V106M/V和Y181C位點在CRF85_BC亞型中耐藥突變率較高，其中V179D/E突變會降低NNRTI類藥物的敏感性[16],后續工作中應加強對該位點的關注，且CRF85_BC亞型是近年來四川地區新鑒定的重組亞型[17]，從分析結果可以看出該毒株已成為四川地區耐藥株的主要亞型之一，耐藥突變頻率較高，提示該毒株傳播速度快，流行范圍廣，應加強監測，及時進行干預。產生耐藥的最主要原因之一是服藥依從性差，按時服藥能夠降低耐藥發生的風險，近一半患者是由于不按要求服藥等原因導致體內藥物不能穩定保持在最適濃度，造成病毒株在藥物壓力下產生突變，發生耐藥。服藥依從性是決定抗病毒治療成功的最關鍵因素[18]，因此在啟動抗病毒治療前首先要做好依從性教育，加強對患者的服藥監督，并定期評估。今后仍需對包括未治療人群在內的艾滋病感染者加強耐藥監測，還可以通過分子傳播網絡的建立判斷耐藥株的傳播情況，針對性的對重點案例進行調查干預，防止耐藥株的進一步傳播和擴散。