不同核酸提取試劑盒對(duì)血漿游離DNA提取效果的比較*

方仲表，沈偉鋒，饒煥新，章余旋，潘志文,吳 歐△

1.浙江樹(shù)人大學(xué)樹(shù)蘭國(guó)際醫(yī)學(xué)院，浙江杭州 310015；2.中翰盛泰生物技術(shù)股份有限公司，浙江杭州 311100；3.浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江杭州 310022

游離DNA(cfDNA)是一種片段化的胞外核苷酸片段,主要以游離形式存在于血液之中或以蛋白質(zhì)結(jié)合形式附著于細(xì)胞表面。在1948年研究者首次發(fā)現(xiàn)了血液cfDNA的存在[1-2]。目前腫瘤組織樣本是檢測(cè)腫瘤基因突變位點(diǎn)的主要材料,但其在臨床上存在取材困難、患者依從性差、檢測(cè)周期長(zhǎng)等諸多不足。而外周血因其具有無(wú)創(chuàng)傷性和實(shí)時(shí)檢測(cè)的絕對(duì)優(yōu)勢(shì),且與組織檢測(cè)結(jié)果的一致性可達(dá)80%以上[5]。因此,近年來(lái),血漿中的cfDNA在腫瘤的液體活檢領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[3-5]。由于血漿中游離DNA片段較短,含量極低,且易于降解[6],如何高效提取cfDNA成為亟待解決的難題。目前市面上血漿cfDNA提取試劑盒較多,但是不同試劑盒的提取方法和提取效率上存在差異。硅膠膜吸附柱法和磁珠法是目前主流的cfDNA提取手段[7-8]。本研究選取了市場(chǎng)上較有代表性的Qiagen公司的Circulating Nucleic Acid kit(硅膠膜吸附柱法,以下簡(jiǎn)稱Qiagen)和北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)的大體積游離核酸提取試劑盒(磁珠法,以下簡(jiǎn)稱天根),從cfDNA提取濃度、純度,人表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因突變陽(yáng)性檢出率、重復(fù)性等方面評(píng)估兩種提取試劑盒的性能表現(xiàn),以期為臨床上對(duì)人EGFR突變基因的檢測(cè)提供更經(jīng)濟(jì)、有效的商品化試劑盒的選擇提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集浙江省腫瘤醫(yī)院肺癌晚期患者的血漿樣本100例,且院方已使用廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司生產(chǎn)的人EGFR突變基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)出血漿樣本的突變位點(diǎn)。

1.2儀器與試劑 磁珠法大體積游離核酸提取試劑(北京天根生化科技有限公司，貨號(hào)：DP-710)；硅膠膜吸附住法Circulating Nucleic Acid kit(德國(guó)Qiagen公司，貨號(hào)：55114)；人EGFR突變基因檢測(cè)試劑盒(多重?zé)晒釶CR法)由杭州中翰盛泰生物技術(shù)股份有限公司提供(批號(hào)：EGF2011002)；NanoDrop超微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)；ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Thermo公司)；高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)。

1.3方法

1.3.1cfDNA提取 醫(yī)院收集到肺癌晚期患者外周血樣本后,立即離心分離血漿。用Qiagen和天根試劑盒分別進(jìn)行提取。(1)Qiagen提取步驟：取1.5 mL離心管依次加入蛋白酶K、2 mL血漿樣本、裂解ACL緩沖液,振蕩混勻后在60 ℃下裂解孵育30 min,添加緩沖液ACB振蕩混勻并在冰上孵育5 min,將混合物放入QIAamp Mini色譜柱的試管延長(zhǎng)器中使裂解物完全通過(guò)色譜柱,在色譜柱依次上樣緩沖液ACW1、ACW2、無(wú)水乙醇,取下色譜柱置于心得采集管中在56 ℃下孵育10 min,丟棄采集管并將色譜柱置于1.5 mL洗脫管中,加入50 μL 洗脫緩沖液AVE,室溫孵育3 min,離心1 min洗脫核酸并將溶液轉(zhuǎn)移保存。(2)天根提取步驟：取1.5 mL離心管依次加入2 mL血漿、裂解液、蛋白酶 K、磁珠,渦旋振蕩混勻后室溫孵育20 min,將離心管置于磁力架上去除液體,加入750 μL緩沖液GDF混勻并置于磁力架去除液體,加入750 μL漂洗液PWG振蕩混勻并置于磁力架去除液體,加入50 μL洗脫緩沖液TBC,56 ℃孵育5 min,將核酸溶液轉(zhuǎn)移并保存。

1.3.2提取后cfDNA濃度、純度檢測(cè) 取12例血漿樣本用Qiagen和天根提取cfDNA,使用超微量紫外分光光度儀對(duì)cfDNA進(jìn)行濃度、純度檢測(cè),每例樣本重復(fù)測(cè)3次,具體操作步驟按照超微量紫外分光光度儀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。對(duì)測(cè)得提取后cfDNA的濃度、純度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,評(píng)價(jià)兩試劑盒在提取cfDNA濃度、純度方面的優(yōu)劣。

1.3.3熒光定量PCR法(qRT-PCR)分析EGFR基因突變檢出情況 采用人EGFR突變基因檢測(cè)試劑盒(多重?zé)晒釶CR法),通過(guò)ABI 7500定時(shí)熒光定量PCR儀,檢測(cè)兩種試劑盒提取后的cfDNA的EGFR基因突變檢測(cè)情況。具體步驟按照人EGFR突變基因檢測(cè)試劑盒(多重?zé)晒釶CR法)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 s,70 ℃ 20 s,65 ℃ 20 s,共15個(gè)循環(huán)；95 ℃ 1 s,70 ℃ 20 s,60 ℃收集熒光信號(hào)30 s,共30個(gè)循環(huán)。用ABI 7500 software(v2.3)分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1Qiagen、天根兩種游離核酸提取試劑盒的基本情況 見(jiàn)表1。

表1 游離核酸提取試劑盒基本情況

2.2核酸濃度及純度的比較 由表2可知,與Qiagen相比,天根試劑盒提取后樣本NO.2的核酸濃度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),其余樣本的核酸濃度顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩種試劑盒所提取的cfDNA純度數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。Qiagen試劑盒提取出的cfDNA的A260/A280比值為1.8～2.2,而天根試劑盒提取得到的cfDNA的A260/A280比值均明顯低于1.7,蛋白質(zhì)污染嚴(yán)重。

表2 兩種試劑盒提取的cfDNA的濃度

表3 兩種試劑盒提取的cfDNA純度

2.3擴(kuò)增結(jié)果分析

2.3.1陽(yáng)性檢出率結(jié)果對(duì)比 表4結(jié)果顯示,Qiagen試劑盒提取的血漿cfDNA突變位點(diǎn)檢出結(jié)果與已知突變位點(diǎn)信息一致,突變位點(diǎn)陽(yáng)性檢出率為100%。天根試劑盒提取的血漿cfDNA中,樣本NO.2的突變位點(diǎn)19del,樣本NO.5的突變位點(diǎn)T790M,樣本NO.9的突變位點(diǎn)G719X出現(xiàn)漏檢,突變位點(diǎn)陽(yáng)性檢出率為85%。所有樣本的IC基因均被檢出。從結(jié)果中可以表明Qiagen試劑盒在陽(yáng)性檢出率方面要優(yōu)于天根試劑盒。

表4 兩種試劑盒提取cfDNA突變位點(diǎn)的陽(yáng)性檢出率

續(xù)表4 兩種試劑盒提取cfDNA突變位點(diǎn)的陽(yáng)性檢出率

2.3.2重復(fù)性結(jié)果對(duì)比與分析 通過(guò)兩試劑盒提取的cfDNA檢出指標(biāo)Ct值的CV值來(lái)分析兩種不同試劑盒對(duì)EGFR基因突變的重復(fù)性的影響。見(jiàn)表5。結(jié)果表明,Qiagen試劑盒提取的cfDNA的檢出結(jié)果Ct值的CV值均小于5%,而天根試劑盒的樣本NO.1中19del檢測(cè)結(jié)果的Ct值的CV值大于5%。

表5 cfDNA檢出指標(biāo)Ct值的重復(fù)性結(jié)果

3 討 論

液體活檢,特別是對(duì)cfDNA的分析,已經(jīng)成為腫瘤學(xué)中一種很有前景的非侵入性診斷方法[9]。因其無(wú)創(chuàng)性的特點(diǎn),cfDNA作為“液體組織”已顯示出了非常重要的臨床應(yīng)用前景[10-11]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是最常見(jiàn)的肺癌亞型[12]。EGFR基因是NSCLC患者的腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的驅(qū)動(dòng)基因,NSCLC患者中常見(jiàn)的EGFR突變類型是19號(hào)外顯子缺失突變(19del)和21號(hào)外顯子L858R點(diǎn)突變,除此以外,還有T790M點(diǎn)突變和20號(hào)外顯子插入突變(20ins)等類型[13]。研究表明，25%的NSCLC患者就診時(shí)已是晚期,此時(shí)進(jìn)行手術(shù)診斷或連續(xù)活檢可能無(wú)法完成[15],因此,通過(guò)液體活檢的方法,從血液中提取cfDNA可作為檢測(cè)體基因突變的可行替代方法。通過(guò)獲取血液(血漿)樣本中cfDNA并檢測(cè)其EGFR基因突變狀態(tài)來(lái)評(píng)估NSCLC患者的情況，對(duì)NSCLC患者的診斷和檢測(cè)具有預(yù)后價(jià)值[14-15]。

然而，目前對(duì)cfDNA的定量檢測(cè)仍然面臨問(wèn)題及爭(zhēng)議,缺乏規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)化的流程[16],cfDNA的提取方法和定量方法也是決定實(shí)驗(yàn)誤差的主要因素[17]。有研究表明，不同的提取方法及使用不同提取試劑盒在提取cfDNA的效率上存在很大差異[18-19]。因此,本研究采集了多例肺癌晚期患者的血漿樣本,且醫(yī)院已提供的了該血漿樣本中EGFR突變基因的突變位點(diǎn)信息。采用Qiagen和天根分別提取血漿樣本中的cfDNA,再通過(guò)人EGFR突變基因檢測(cè)試劑盒(多重?zé)晒舛縋CR法)分析兩種試劑盒提取血漿中cfDNA的提取效果。通過(guò)比較目前市場(chǎng)上具有代表以上兩種提取試劑盒(分別代表硅膠膜吸附柱法和磁珠法)的提取性能,建立評(píng)價(jià)cfDNA提取優(yōu)劣的方法,為cfDNA在臨床EGFR突變基因檢測(cè)選取更經(jīng)濟(jì)、有效的cfDNA提取試劑盒提供依據(jù)。

本研究首先對(duì)試劑盒基本情況進(jìn)行了評(píng)價(jià)。在成本方面,Qiagen試劑盒單人次的價(jià)格雖要高于天根試劑盒，但在提取時(shí)間方面,Qiagen試劑盒在手提時(shí)長(zhǎng)方面耗時(shí)要少于天根試劑盒。且相關(guān)資料表明，在需要提取大量樣本cfDNA且均為人工提取的情況下,Qiagen試劑盒的QIAamp Mini色譜柱可以通過(guò)真空泵抽取液體顯著節(jié)省提取時(shí)間。

cfDNA提取優(yōu)劣可以通過(guò)多種方面進(jìn)行評(píng)價(jià)[18-19]。本研究則在cfDNA提取濃度、純度,EGFR突變基因陽(yáng)性檢出率、重復(fù)性方面對(duì)兩種試劑盒所提取的DNA質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)分析。在cfDNA濃度、純度檢測(cè)方面,采用超微量紫外分光光度儀對(duì)多例血漿樣本中提取得到的DNA進(jìn)行檢測(cè)分析。提取濃度方面的結(jié)果表明,Qiagen提取的大部分樣本中cfDNA濃度要顯著高于天根。A260/A280比值可以用于表示DNA的純度,質(zhì)量較好的DNA純度A260/A280比值應(yīng)為1.8～2.0,比值小于1.8時(shí),則可能存在蛋白質(zhì)或酚類的污染；大于2.0時(shí),則可能存在RNA或異硫氰酸胍殘留[20]。提取純度方面的結(jié)果表明,Qiagen提取的cfDNA純度有部分結(jié)果達(dá)到了1.8～2.0,其余結(jié)果均在2.0左右，且不超過(guò)2.1,表明提取中雖存在輕微的RNA污染，但提取的cfDNA純度較好；天根提取的cfDNA純度均低于1.7,表明其提取過(guò)程中均存在嚴(yán)重的蛋白質(zhì)或多糖污染。由于cfDNA本身提取難度較大,而Qiagen在提取過(guò)程中仍有部分結(jié)果達(dá)到了理想?yún)^(qū)間，因此,Qiagen在提取純度方面要優(yōu)于天根。總體而言，Qiagen試劑盒提取出的cfDNA品質(zhì)更好。

人EGFR突變基因檢測(cè)試劑盒(多重?zé)晒釶CR法)用于體外定性檢測(cè)人非小細(xì)胞肺癌患者經(jīng)福爾馬林固定的石蠟包埋組織樣本或血漿樣本中的人類EGFR突變基因。qRT-PCR因其具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單且耗時(shí)短等優(yōu)勢(shì),廣泛應(yīng)用于臨床疾病的診斷和評(píng)估[21-22]。本研究根據(jù)qRT-PCR對(duì)cfDNA擴(kuò)增結(jié)果的Ct值進(jìn)行分析。Ct值即循環(huán)閾值,表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù),它與起始模板的濃度負(fù)相關(guān)[21]。因此,若Ct值越小,則表明提取效率越高。Cut-off值表示陽(yáng)性和陰性結(jié)果的臨界值,是判斷檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)。在本研究中,cfDNA的EGFR突變位點(diǎn)擴(kuò)增結(jié)果的Ct值小于Cut-off值則表示該突變位點(diǎn)檢出結(jié)果呈陽(yáng)性。本研究用Qiagen和天根對(duì)20例血漿樣本分別進(jìn)行cfDNA提取,共提取40次,用RT-qPCR進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示,Qiagen和天根提取的血漿cfDNA突變位點(diǎn)陽(yáng)性檢出率分別為100%和85%,表明Qiagen提取的cfDNA陽(yáng)性檢出率要優(yōu)于天根。

良好的重復(fù)性是檢測(cè)系統(tǒng)在進(jìn)行其他方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的前提[23]。因此,除提取濃度、純度和EGFR突變基因陽(yáng)性檢出率之外,重復(fù)性也是判斷試劑盒性能的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示,Qiagen提取的血漿cfDNA中,EGFR突變位點(diǎn)19del和L858R及IC通道的Ct值的CV值均小于5%,表明Qiagen試劑盒提取重復(fù)性和穩(wěn)定性高,隨機(jī)誤差小；天根提取的血漿cfDNA中,有部分CV值超過(guò)5%,表明天根的提取重復(fù)性和穩(wěn)定性要劣于Qiagen。

綜上所述,本研究在cfDNA提取濃度、純度,EGFR突變基因的陽(yáng)性檢出率、重復(fù)性方面綜合評(píng)估了兩種試劑盒的cfDNA提取效果,研究結(jié)果表明,Qiagen試劑盒在以上幾項(xiàng)性能的表現(xiàn)上均要優(yōu)于天根試劑盒。