NRXN1基因和MECP2基因SNP檢測(cè)及其與兒童自閉癥臨床表現(xiàn)的關(guān)聯(lián)研究*

鄒甜甜，李 勝，方欣怡，柯海燕，魏莉平，沈 翠

鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市婦幼保健院/湖北理工學(xué)院附屬婦幼保健院:1.檢驗(yàn)科;2.超聲科，湖北黃石 435000

兒童自閉癥又稱孤獨(dú)癥，它是一種兒童時(shí)期廣泛性發(fā)育障礙疾病，部分患兒常常與癲癇、精神發(fā)育遲滯、注意缺陷多動(dòng)障礙、進(jìn)食障礙等疾病共病，對(duì)兒童的身心健康造成嚴(yán)重的影響[1]。目前越來越多的研究學(xué)者在積極探索自閉癥發(fā)病原因及機(jī)制，以期為早期干預(yù)及預(yù)防提供重要依據(jù)[2]。楊柳等[3]研究顯示，CD157/BST-1基因rs4301112位點(diǎn)AG基因型和G等位基因可能與兒童自閉癥譜系障礙發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)及病情嚴(yán)重程度有關(guān)。許天友等[4]研究表明，GABRB3基因rs8179184位點(diǎn)CA、AA型與自閉癥患兒的發(fā)病密切相關(guān)。據(jù)此推測(cè)兒童自閉癥的發(fā)病可能與多種基因多態(tài)性有密切聯(lián)系。神經(jīng)軸突蛋白1(NRXN1)及其家族作為自閉癥的候選致病基因已得到廣泛的關(guān)注，且許多研究表明其基因變異會(huì)改變疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[5- 6]。甲基CpG結(jié)合蛋白-2(MECP2)是雷特綜合征的致病基因，但其基因突變與其他神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙性疾病也有密切聯(lián)系[7-8]。YUKA等[9]調(diào)查顯示，包括NRXN1、MECP2在內(nèi)的多種基因的罕見突變均與自閉癥譜系障礙有關(guān)。本研究主要探討128例自閉癥患兒NRXN1基因(rs1421589位點(diǎn))和MECP2基因(rs2239464位點(diǎn))單核苷酸多態(tài)性(SNP)與自閉癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2019年9月至2021年6月于本院就診或進(jìn)行康復(fù)治療的128例自閉癥患兒(自閉癥組)的臨床資料，平均(5.34±2.32)歲，男88例，女40例；同期選取本院145例體檢健康兒童作為對(duì)照組，平均(5.46±2.17)歲，男86例，女59例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)自閉癥患兒由神經(jīng)科醫(yī)生依據(jù)第5版《診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)：精神障礙》進(jìn)行專業(yè)診斷；(2)臨床資料齊全，且均為初次確診；(3)所有兒童均為漢族人群；(4)研究經(jīng)醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，家屬簽署書面知情同意書，健康兒童無多動(dòng)癥、智力障礙及自閉癥等神經(jīng)發(fā)育障礙類疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有先天性心臟病等嚴(yán)重先天性疾病及惡性腫瘤；(2)有厭食癥或癔癥等精神心理性疾??；(3)有重要臟器組織功能不全及其他遺傳性疾病。

1.2儀器與試劑 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(型號(hào)：T100)購自美國Bio-Rad公司；紫外分光光度計(jì)(型號(hào)：A30221)購自美國Thermo Fisher公司?；蚪MDNA提取試劑盒(貨號(hào)：D1800)購自上海晶風(fēng)生物科技有限公司；Taq DNA polymerase(貨號(hào)：RE0110-0.5kU)購自北京金克隆生物技術(shù)有限公司；PCR Buffer(貨號(hào)：)購自瑞士Roche公司；dNTP溶液(貨號(hào)：YS-10303RJ)購自上海雅吉生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1觀察指標(biāo) 采用孤獨(dú)癥兒童行為檢查量表(ABC)評(píng)分測(cè)評(píng)患兒感覺、交往、語言、軀體運(yùn)動(dòng)、生活自理5個(gè)因子，共57個(gè)條目(228分)，分?jǐn)?shù)超過53分可能患自閉癥；超過67分可明確診斷自閉癥。采用兒童孤獨(dú)癥評(píng)定量表(CARS)評(píng)分測(cè)評(píng)患兒病情嚴(yán)重程度，量表評(píng)分共60分，<30分為正常；30～<37分，且低于3分的項(xiàng)目不到5項(xiàng)為輕中度；37～60分，且至少5項(xiàng)評(píng)分高于3分為重度。

1.3.2NRXN1和MECP2基因型檢測(cè) 采集患兒確診后外周靜脈血樣，室溫靜置30～60 min，3 000 r/min離心15 min后收集上層血清，置于-80 ℃保存待測(cè)。參照DNA提取試劑盒說明書提取血清基因組DNA，提取后采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度及純度。PCR用于擴(kuò)增DNA，其體系包括：DNA模板 2.0 μL，上下游引物各0.5 μL，MgCl21.5 μL，dNTP 2.0 μL，PCR Buffer 2.5 μL，Taq DNA polymerase 0.2 μL，ddH2O 15.8 μL。反應(yīng)條件均為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，45個(gè)循環(huán)，引物序列見表1。本研究基因分型由北京博淼生物科技有限公司采用Sequenom MassArray platform分型技術(shù)進(jìn)行。

表1 PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1兩組NRXN1基因和MECP2基因SNP基因型分布及Hardy-Weinberg(H-W)遺傳平衡檢驗(yàn) 對(duì)照組和自閉癥組NRXN1基因在rs1421589位點(diǎn)上檢出CC型、CT型、TT型3種基因型，對(duì)照組中CC型基因型(49.66%)比例較高，自閉癥組中TT型基因型(57.81%)比例較高，經(jīng)吻合度檢驗(yàn)，對(duì)照組和自閉癥組NRXN1基因SNP分布均符合Hardy-Weinberg平衡法則(χ2=1.386、5.069，P>0.05)；MECP2基因在rs2239464位點(diǎn)上檢出AA型、AG型、GG型3種基因型，對(duì)照組中AA型基因型(50.34%)比例較高，自閉癥組中GG型基因型(49.21%)比例較高，經(jīng)吻合度檢驗(yàn)，對(duì)照組和自閉癥組MECP2基因SNP分布均符合Hardy-Weinberg平衡法則(χ2=4.297、5.508，P>0.05)。見表2、3。

表2 兩組NRXN1基因(rs1421589位點(diǎn))SNP基因型分布及H-W遺傳平衡檢驗(yàn)[n(%)]

表3 兩組MECP2基因(rs2239464位點(diǎn))SNP基因型分布及H-W遺傳平衡檢驗(yàn)[n(%)]

2.2NRXN1和MECP2各基因型與自閉癥患兒臨床行為的關(guān)系 NRXN1和MECP2不同基因型自閉癥患兒感覺、交往、語言、軀體運(yùn)動(dòng)、生活自理得分及ABC總分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4、5。

表4 NRXN1各基因型ABC得分比較分)

表5 MECP2各基因型ABC得分比較分)

2.3NRXN1和MECP2各基因型與自閉癥患兒疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系 NRXN1和MECP2不同基因型自閉癥患兒疾病嚴(yán)重程度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6、7。

表6 NRXN1各基因型與自閉癥患兒疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系(n)

表7 MECP2各基因型與自閉癥患兒疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系(n)

2.4NRXN1和MECP2基因型影響自閉癥發(fā)生的Logistic回歸分析 將兒童自閉癥是否發(fā)生作為因變量，校正年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)等混雜因素后，分別以NRXN1基因的3種基因型(CC型、CT型、TT型)、MECP2基因的3種基因型(AA型、AG型、GG型)為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示TT型基因型(rs1421589位點(diǎn))、GG型基因型(rs2239464位點(diǎn))是影響自閉癥發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表8、9。

表8 NRXN1基因型影響自閉癥發(fā)生的Logistic回歸分析

表9 MECP2基因型影響自閉癥發(fā)生的Logistic回歸分析

3 討 論

自閉癥的臨床表現(xiàn)主要包括感覺、交往、語言、軀體運(yùn)動(dòng)、生活自理等方面的缺陷和障礙[10]。自閉癥病因目前尚不十分明確，但許多證據(jù)表明其發(fā)生具有明顯的遺傳背景，認(rèn)為先天性的基因異常與后天環(huán)境的相互作用可能是自閉癥發(fā)病及表型多樣化的重要因素[11- 12]。目前兒童自閉癥尚缺乏有效的治療方法，患兒往往預(yù)后較差，即使接受較好的訓(xùn)練也很難達(dá)到同齡兒童的發(fā)育水平，部分患兒甚至終生需要他人監(jiān)護(hù)，加重家庭及社會(huì)的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)[13]。

目前發(fā)現(xiàn)自閉癥相關(guān)的多個(gè)基因中，許多與腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)異常、突觸功能等有關(guān)，表明神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)與自閉癥的發(fā)病密切相關(guān)[14-15]。NRXN基因家族廣泛表達(dá)于神經(jīng)元中，可編碼一類有多態(tài)性的細(xì)胞表面蛋白，參與細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用[16]。NRXN1基因可形成α-軸突蛋白和β-軸突蛋白，其中α-軸突蛋白參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、功能性突觸的形成及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[17]。MECP2最早發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，主要存在于突觸后區(qū)和神經(jīng)元核內(nèi)，在神經(jīng)元發(fā)育、分化等過程中均有重要作用[18]。本研究中NRXN1基因rs1421589位點(diǎn)及MECP2基因rs2239464位點(diǎn)在自閉癥患兒及健康兒童中均符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明所選樣本均來自同一孟德爾群體，可進(jìn)行群體遺傳學(xué)研究。NRXN1基因rs1421589位點(diǎn)TT型自閉癥患兒感覺、交往、語言等臨床表現(xiàn)得分均高于CC型和CT型，同時(shí)MECP2基因rs2239464位點(diǎn)GG型患兒各臨床表現(xiàn)得分高于AA型和AG型，且TT型及GG型基因型中重度患兒比例更高。提示NRXN1基因位點(diǎn)rs1421589 C-T突變和MECP2基因位點(diǎn)rs2239464 A-G突變可能與自閉癥患兒的發(fā)病及嚴(yán)重程度有關(guān)。而戚小兵等[17]研究中，NRXN1基因rs1045881位點(diǎn)、rs11885814位點(diǎn)SNP與自閉癥易感性無關(guān)，其與本研究結(jié)果的差異可能由所選位點(diǎn)不同導(dǎo)致，同時(shí)也可能與遺傳異質(zhì)性有關(guān)。TANTRA等[19]研究表明，MECP2基因rs2239464位點(diǎn)與攻擊性社會(huì)行為有關(guān)，結(jié)合本研究結(jié)果中rs2239464位點(diǎn)SNP與自閉癥的關(guān)系，進(jìn)一步提示MECP2基因rs2239464位點(diǎn)可能與神經(jīng)系統(tǒng)疾病有重要聯(lián)系。此外，本研究中NRXN1基因rs1421589位點(diǎn)TT型基因型、MECP2基因rs2239464位點(diǎn)GG型基因型是影響自閉癥發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，進(jìn)一步表明NRXN1基因(rs1421589位點(diǎn))和MECP2基因(rs2239464位點(diǎn))SNP可能參與自閉癥的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，NRXN1基因(rs1421589位點(diǎn))和MECP2基因(rs2239464位點(diǎn))SNP與自閉癥的發(fā)生存在相關(guān)性，rs1421589位點(diǎn)TT型基因型、rs2239464位點(diǎn)GG型基因型可以增加兒童自閉癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)及自閉癥嚴(yán)重程度。但本研究同時(shí)存在一定的不足之處，樣本選取受制于地區(qū)及人群，后續(xù)需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)NRXN1基因和MECP2基因SNP與自閉癥患兒發(fā)病及臨床表現(xiàn)的相關(guān)性。