甲砜霉素與牛血清白蛋白相互作用的熱力學研究

趙雪卿,王樹照

(呂梁學院 化學化工系，山西 離石 033001)

血清白蛋白(Serum albumin，簡稱SA)是一種球狀蛋白，它在生物體內血漿中占據主導地位，有著非常重要的作用[1].在生物體中，血清白蛋白可以通過運輸膽色素、類固醇、氨基酸等物質達到運輸的作用，也維持著血液正常的滲透壓，在生命過程中有重要的意義[2].BSA具有水溶性，它與人血清白蛋白(HSA)結構同源性和相似的三維結構達到了76%，大多數的有機藥物小分子能夠和牛血清白蛋白結合，從而運輸到靶組織器官中，故被頻繁地選擇為研究藥物與SA相互作用的蛋白質模型[3].甲砜霉素(Thiamphenicol，簡稱Tap)，主要用于治療由敏感菌引起的呼吸道、腸道等感染.Tap的毒性比氯霉素小，現已成為氯霉素的替代品，但也逐漸被發現其對人體會產生危害[4].本文通過研究不同溫度下甲砜霉素與牛血清白蛋白的光譜行為，獲得了其相互作用機制、作用力類型以及Tap對BSA構象的影響，這為開發新一代抗菌藥物具有重要意義.

1 實驗試劑和儀器

牛血清蛋白(BSA，上海金穗生物科技有限公司)5×10-4mol·L-1，用時稀釋250倍即2×10-6mol·L-1；甲砜霉素(優級純，大連科寶生物科技有限公司)2×10-3mol·L-1，用時稀釋100倍即為2×10-5mol·L-1；pH為7.40的Tris-HCl緩沖溶液，實驗所用水均為二次蒸餾水.

LS-45型熒光分光光度計(美國Perkin Elmer公司)，SYC-15B恒溫槽(南京肯凡電子科技有限公司)，pHS-3C酸度計(上海儀電科學儀器股份有限公司).

2 實驗方法

不同溫度下，用移液槍準確吸取1.5 mL 2.0×10-6mol·L-1BSA溶液于比色皿中，固定激發波長為278 nm，依次向比色皿中滴加不同體積濃度為2.0×10-5mol·L-1Tap溶液，記錄300～450 nm發射光譜.當激發波長范圍介于240～320 nm時，分別掃描Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的同步熒光光譜.

3 結果與討論

3.1 熒光光譜

圖1～3是不同溫度下，隨著甲砜霉素濃度的增加，BSA的熒光光譜.由圖可知牛血清白蛋白的最大發射波長處于344 nm，隨著甲砜霉素的體積逐漸增加，牛血清白蛋白的熒光強度呈現下降趨勢，這說明甲砜霉素與BSA發生了相互作用，導致BSA的熒光猝滅.

圖1 25℃下甲砜霉素對牛血清白蛋白的猝滅光譜圖1.5 mL牛血清白蛋白(2.0×10-6mol·L-1)pH=7.4 Tris-HCl緩沖溶液甲砜霉素(2.0×10-5mol·L-1)的濃度從1到12依次為：(0，0.03，0.98，1.59，2.25，2.56，2.86，3.15，3.43，3.95，4.39，4.94)×10-6mol·L-1

圖2 35 ℃下甲砜霉素對牛血清白蛋白的熒光猝滅圖譜1.5 mL牛血清白蛋白(2.0×10-6mol·L-1)pH=7.4 Tris-HCl緩沖溶液甲砜霉素(2.0×10-5mol·L-1)的濃度從1到12依次為：(0，0.03，1.07，1.76，2.09，2.40，2.71，3.00，3.29，3.83，4.33，5.07)×10-6mol·L-1

圖3 45 ℃下甲砜霉素對牛血清白蛋白的熒光猝滅圖譜1.5 mL牛血清白蛋白(2.0×10-6mol·L-1)pH=7.4 Tris-HCl緩沖溶液甲砜霉素(2.0×10-5mol·L-1)的濃度從1到9依次為：(0，0.03，0.20，1.07，1.71，2.25，2.81，3.43，4.08)×10-6mol·L-1

3.2 熒光猝滅類型判斷

分子熒光猝滅主要分為動態猝滅和靜態猝滅.其中，動態猝滅主要發生在猝滅劑與發光物質的激發態(Si)分子之間的相互作用，靜態猝滅則主要發生在猝滅劑與發光物質的基態(S0)分子之間的相互作用[5-8].其中動態猝滅涉及到的是能量轉移過程或電子轉移過程，所以不會影響到血清白蛋白的構象.靜態猝滅則會影響到BSA的構象及其生理活性[9].為了確定甲砜霉素Tap與牛血清白蛋白SA相互作用的猝滅類型，假定其為動態猝滅，可利用Stern-Volmer公式(公式1)計算動態猝滅常數.

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q]

(1)

式中Kq：雙分子猝滅過程的速率常數；τ0：沒有加甲砜霉素時測得的牛血清白蛋白的熒光壽命；[Q]為甲砜霉素的平衡濃度；F0為只有BSA溶液時的熒光強度；F為加入Tap溶液時的BSA的熒光強度；KSV叫做S-V猝滅常數.

根據Stern-Volmer方程作圖可得：

由圖4可得出下表：

圖4 不同溫度下甲砜霉素與BSA熒光猝滅的Stern-Volmer圖

從表1中可以得出，25 ℃下Tap與BSA的猝滅常數為1.44×105L·mol-1，熒光分子的平均壽命τ0約等于10-8s，甲砜霉素對牛血清白蛋白的雙分子猝滅常數Kq遠大于2×1010L·mol-1·S-1[10]，故可以得出Tap對BSA是靜態猝滅，改變溫度后，Tap對BSA的猝滅方式仍為靜態猝滅.在不同溫度下比較S-V猝滅常數，可以看出隨著溫度的升高，其數值在不斷的降低.出現該現象可能是由于溫度的升高，BSA溶液的黏度降低；另一方面隨著溫度的升高，溶液中分子，熱運動加快，以至于分子的擴散系數增大，從而引起絡合物的穩定性降低，導致靜態猝滅的程度減小.

表1 S-V方程相關系數

3.3 結合常數KA與結合位點數n的計算

通過表1分析可得出結論，無論在哪個溫度下，甲砜霉素與牛血清白蛋白的熒光猝滅類型都是靜態猝滅.故可用L-B方程求得甲砜霉素與牛血清白蛋白的結合位點以及結合常數.

L-B方程：

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q]

(2)

式中F0：未加甲砜霉素時牛血清白蛋白的熒光強度；F;加入甲砜霉素時的牛血清白蛋白的熒光強度；KA；Tap和BSA的結合常數；n：Tap和BSA的結合位點數.

改變溫度條件，通過計算滴加甲砜霉素的濃度，記錄滴加不同濃度時的熒光強度，即可通過L-B方程，擬合得圖5，求得在25 ℃、35 ℃、45 ℃下的結合位點數n，結合常數KA.方程的斜率為n，截距為lgKA.

圖5 不同溫度下甲砜霉素與牛血清白蛋白的雙對數圖

由圖5可以得到以下參數：

通過表2可以得出25 ℃、35 ℃、45 ℃的結合位點數分別為1.40、1.23、1.02；結合常數分別為1.41×107L·mol-1、2.09×106L·mol-1、1.78×105L·mol-1.二者的結合常數較大，由此可得出甲砜霉素與牛血清白蛋白之間結合作用較強，可以被蛋白質儲存和運輸.當溫度升高時其結合常數降低，可能是由于隨著溫度的升高，甲砜霉素與牛血清白蛋白所形成的復合物穩定性降低，使得猝滅常數減小，這與靜態猝滅的規律符合.結合位點n也隨溫度的升高而降低，說明在結合過程中溫度的影響非常重要[11].因此，在甲砜霉素和牛血清白蛋白結合過程中，溫度是一個很重要的因素.

表2 L-B方程相關參數

3.4 作用力類型的判斷

有機藥物小分子與蛋白質等大分子之間的作用力主要為范德華力、靜電引力、氫鍵和疏水力等.以上相互作用力也可通過焓變、熵變等的大小和符號來判斷.

其中的的ΔH和ΔS可利用范特霍夫方程求得：

(3)

式中KA為25 ℃、35 ℃、45 ℃下的結合常數；R為摩爾氣體常數，單位為J/(mol·K).根據計算所得出的焓變ΔH和熵變ΔS，利用吉布斯-亥姆霍茲公式，即可求出Tap與BSA反應的ΔG：

ΔG=ΔH-TΔS

(4)

依據圖6中的斜率和截距可求得焓變ΔH和熵變ΔS(焓變和熵變的數值隨溫度的變化不大，因此可看為定值)再根據式(4)計算出不同溫度下的ΔG.具體結果可見表3：

圖6 甲砜霉素與牛血清白蛋白相互作用的范特霍夫方程

表3 不同溫度下甲砜霉素與BSA相互作用的熱力學參數

通過上表，可以發現體系的ΔH<0，ΔS<0，從而判斷牛血清白蛋白與甲砜霉素之間的作用力為氫鍵和范德華力.ΔG<0，說明此反應為自發反應.

3.5 不同溫度下甲砜霉素與BSA相互作用的構象分析

同步熒光所測得的Δλ=60 nm與Δλ=15 nm光譜分別表現為Trp和Tyr的特征熒光.其中，在同一濃度下，Trp特征熒光要比Tyr的特征熒光要強.并且它們兩個的最大λem與它們所處環境的極性有關.

Δλ=60 nm時，此時表現出色氨酸的特征熒光，Δλ=15 nm時，此時表現出酪氨酸的特征熒光.圖7到圖12為不同溫度下的同步熒圖，表明在不同溫度下Trp殘基的熒光強度逐漸減弱，且最大λem向長波方向移動，發生了紅移.說明隨著甲砜霉素的不斷滴入使得牛血清白蛋白中Trp殘基微環境的極性增加，疏水性減弱.在不同溫度下Tyr殘基的熒光強度都逐漸減弱，最大激發波長向短波方向移動，發生了藍移.該現象表明隨著甲砜霉素的不斷滴入使得BSA中Tyr殘基微環境的極性減少，疏水性增強.

圖7 25 ℃下Δλ=60 nm時Tap對BSA的同步熒光光譜

圖8 25 ℃下Δλ=15 nm時Tap對BSA的同步熒光光譜

圖9 35 ℃下Δλ=60 nm時Tap對BSA的同步熒光光譜

圖10 35 ℃下Δλ=15 nm時Tap對BSA的同步熒光光譜

圖11 45 ℃下Δλ=60nm時Tap對BSA的同步熒光光譜

圖12 45 ℃下Δλ=15 nm時Tap對BSA的同步熒光光譜

4 結論

不同溫度下，甲砜霉素與牛血清白蛋白的作用機制均為靜態猝滅，并隨著溫度的升高，甲砜霉素與牛血清白蛋白的相互作用的結合位點數逐漸降低，結合常數降低，二者結合的作用力為氫鍵與范德華力，同步熒光表明甲砜霉素對牛血清白蛋白的構像有影響.